摘要：本文采用推挽灌流技术、 放射免疫测定法, 观察褪黑素(melatonin, MEL)对大鼠中脑导水管周围灰质(PAG)推挽灌流液中β-内啡肽(β-Ep)、亮氨酸脑啡肽(L-EK)含量的影响, 以探讨MEL镇痛效应的中枢机制。结果显示, 给药组大鼠腹腔注射 (ip) MEL 110 mg/kg后30～50 min, pAG灌流液中β-Ep含量显著增加, 而L-EK含量未见显著变化; 在推挽灌流同时用50℃热水刺激甩尾法测定痛阈, 可见ip MEL 110 mg/kg后40 min, 大鼠痛阈显著升高。上述结果提示, MEL可促进PAG内β-Ep的释放, 这可能是其发挥镇痛效应的中枢机制之一。褪黑素(melatonin, MEL)是一种存在于机体内的重要的神经内分泌活性物质, 主要由松果体合成分泌,化学结构为N-乙酰-5-甲氧基色胺。体内尤其是脑内存在褪黑素受体, MEL是其固有的内源性配体［1,2］。MEL具有某些重要的生理、药理作用［3,4］。动物行为测痛试验表明, 外源性给予MEL可显著提高动物痛阈并可被纳洛酮所拮抗［5～8］, 对动物无身体依赖性作用［9］;小鼠的基础痛阈和阿片类药物的镇痛效应均呈昼夜节律, 切除松果体昼夜节律显著减弱［5,10］, 提示MEL在痛觉调制和镇痛中发挥着重要作用。然而,有关MEL镇痛效应的中枢机制尚未见文献报道。我们的预试工作表明［11］, 侧脑室注射(icv)、 腹腔注射(ip)MEL均可显著提高大鼠痛阈,前者提高痛阈50%的剂量约为后者的1/100; icv纳洛酮可显著拮抗ip MEL提高大鼠痛阈效应, 提示中枢神经系统可能是MEL发挥镇痛效应的重要部位,其作用机制涉及脑内内阿片肽系统。

脑内 β-内啡肽、 脑啡肽在痛觉调制和镇痛中发挥着重要的作用［12,13］。中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)是内源性痛觉调制系统中一个上行与下行通路中的重要结构, pAG有脑啡肽能胞体和末梢分布, 下丘脑中β-内啡肽纤维沿第三脑室壁终止于PAG［14］。本工作采用推挽灌流结合行为测痛、 放射免疫测定法,观察MEL发挥镇痛效应时PAG中β-内啡肽(β-endorphin, β-Ep)、 亮氨酸脑啡肽(leucine-enkephalin, L-EK)含量的变化,以探讨MEL镇痛效应的中枢机制。

1材料和方法

1.1动物及药品雄性SD大鼠(210～230 g)购自上海医科大学实验动物部, 在光暗周期为12/12 h的实验室饲养, 自由饮水饮食。MEL(Sigma产品) 临用前用无水乙醇溶解, 再加生理盐水配制, 使乙醇的浓度为5%。杆菌肽(bacitracin)为Sigma产品。

1.2推挽灌流实验在戊巴比妥钠(40 mg/kg, ip)麻醉下, 大鼠被固定在江湾I-C型脑立体定向仪上, 参照大鼠脑图谱［15］, 以前囟为零点,在坐标B: -7.4, L: 0.7, H: 5.8定位PAG, 埋植灌流外导管(外径0.9 mm), 用502胶和牙托粉泥固定于颅骨表面。术后注射青霉素钠防止感染。术后第3天, 大鼠被固定在测痛鼠台上开始推挽灌流［16］, 将外径为0.45 mm的内套管插入外导管, 以37℃人工脑脊液恒速(75μl/min)灌流。灌流液收集于1.5 ml的离心管中, 离心管置于冰浴中, 每管加150 μg杆菌肽以防肽类降解。标本于给药前与给药后30～50 min各收集1份, 每份1.5 ml, 储存于－80℃低温冰箱以备放免测定。在收集灌流液同时, 于给药前与给药后40 min测定痛阈(见下文)。灌流结束后经内套管(另备)注入约1 μl氨基黑, 半小时后断头取脑切片以鉴定埋管部位是否正确。

1.3内阿片肽的放免测定采用顺序饱和法加样测定［17］推挽灌流液中β-Ep、 L-EK含量。测定β-Ep时, 样品(灌流液)加样量为10 μl,总反应体积为300 μl; 测定L-EK时, 样品加样量为200 μl, 总反应体积为500 μl。以二抗沉淀法分离与抗体结合的［125I］-β-Ep或［125I］-L-EK和游离的［125I］-β-Ep或［125I］-L-EK,离心去上清后, 沉淀物用SN-695B型γ计数仪计数。以标准品含量的对数为横坐标, 以各管结合值B与最大结合值Bo之比为纵坐标, 绘制标准曲线,根据标准曲线求出测定管的β-Ep或L-EK含量。

1.4痛阈测定大鼠痛阈采用50℃热水刺激甩尾法测定［18］。给药前每隔10 min测1次痛阈, 共测3次, 取其均值为基础痛阈, 给药后40 min再次测定痛阈, 同时进行上述推挽灌流收集灌流液。

1.5统计学处理实验结果均采用 ±sx表示, 两组间的比较采用t检验判断。P＜0.05被认为具有显著性差异。

2结果

2.1MEL对PAG灌流液中β-Ep含量的影响

大鼠14只, 随机分为给药组、 配药液组(对照组), 分别ip MEL 110 mg/kg和5%乙醇生理盐水(配药液), 于给药前及给药后30～50 min内收集PAG推挽灌流液, 放免测定灌流液中β-Ep含量。结果表明, 对照组大鼠ip配药液处理前后灌流液中β-Ep的含量无明显变化(P＞0.05),分别为620±132、 527±176 pg/ml; 给药组大鼠ip MEL后, 灌流液中β-Ep含量为1?260±123 pg/ml,显著高于给药前水平(基础水平)831±86 pg/ml (P＜0.05)。 给药处理前两组灌流液中β-Ep含量差别无显著意义(P＞0.05), 给药处理后 mEL 处理组 β-Ep 含量则显著高于配药液处理组(P＜0.01)(图1), 可见MEL能致PAG推挽灌流液内β-Ep含量升高。

图1.腹腔注射褪黑素对大鼠中脑导水管周围灰质灌流液内β-内啡肽含量的影响

fig.1.Effect of melatonin (ip) on the β-endorphin content in the perfusate of periaqueductal gray of rat. The perfusate was collected 30～50 min before and after administration of melatonin (110 mg/kg, ip) or a vehicle. The bars represent the mean and SEM from 7 rats. **P＜0.01 vs vehicle-treated group;+P＜0.05 vs before treatment.

2.2MEL对PAG灌流液中L-EK含量的影响

用上述方法处理动物,收集PAG推挽灌流液,测定灌流液中L-EK含量。结果显示,对照组大鼠ip配药液前后PAG灌流液中L-EK含量分别为49±15、42±12 pg/ml, 给药组大鼠ip MEL前后灌流液中L-EK含量分别为53±16、55±14 pg/ml, 对照组或给药组给药处理前后L-EK含量均无明显变化(P＞0.05);给药组给药前后灌流液中L-EK含量与对照组比较, 差别无显著意义(P＞0.05)(图2),表明MEL对PAG推挽灌流液内L-EK含量无显著影响。

图2.腹腔注射褪黑素对大鼠中脑导水管周围灰质灌流液内亮氨酸脑啡肽含量的影响

fig.2.Effect of melatonin (ip) on the leucine-enkephalin content in the perfusate of periaqueductal gray of rat. The perfusate was collected 30～50 min before and after administration of melatonin (110 mg/kg, ip) or a vehicle. The bars represent the mean and SEM from 6 rats. There is no significant difference between the groups.

2.3MEL对大鼠痛阈的影响

实验大鼠分组与处理同上, 在进行上述PAG推挽灌流收集灌流液的同时, 测定大鼠痛阈。结果显示, 给药组与对照组间基础痛阈无显著差异(P＞0.05),分别为4.04±0.19、 4.07±0.28 s, 给药组大鼠ip MEL后40 min的痛阈(6.74±0.33 s)显著高于对照组(3.99±0.32 s)(P＜0.001), 也显著高于其基础痛阈(P＜0.001), 表明MEL可显著提高大鼠的痛阈。

3讨论

如前所述［5～8,10］, 内源性和外源性MEL可显著提高动物的痛阈; 临床观察表明, MEL可使丛集性头痛患者疼痛指数明显下降［19］; mEL毒性非常小［20］, 对动物无身体依赖性作用［9］,提示探讨MEL镇痛效应具有学术价值和应用价值。有关MEL镇痛效应的机制尚有待研究。我们的初步工作表明［11］, 中枢神经系统可能是MEL发挥镇痛效应的重要部位,其作用机制涉及脑内内阿片肽系统。在此工作基础上, 为进一步探讨MEL镇痛效应的中枢机制, 本文采用推挽灌流技术结合行为测痛、 放射免疫测定法, 观察MEL对PAG内β-Ep、 l-EK释放的影响。

我们采用大鼠电刺激嘶叫法、 热水刺激甩尾法测定痛阈, 分别观察到ip MEL45～105、 30～120 mg/kg 可产生剂量依赖性镇痛效应,给药后15～20 min起效, 30～40 min达最大效应［8,11］。基于以上工作, 本研究选择ip MEL 110 mg/kg, 观察给药后30～50 min PAG灌流液中内阿片肽含量的变化, 以期了解MEL发挥显著镇痛效应时PAG中内阿片肽释放的变化。结果显示, ip MEL 110 mg/kg后40 min, 大鼠痛阈显著升高, 其时PAG灌流液中β-Ep含量显著升高, 表明MEL可促进PAG内β-Ep的释放。有文献报道［21］, 长时间光照时公羊血中β-Ep水平降低;在下丘脑内侧基底部微量植入MEL, 可使血中β-Ep含量增加。前者系长时间光照导致内源性MEL分泌减少(主要是松果体), 降低了脑内MEL水平,后者系外源性给予MEL, 提高了下丘脑部位MEL水平, 提示提高脑内MEL水平可促进β-Ep的释放。Xu等报道［22］, 腹腔注射 MEL 30 min后取脑测定β-Ep含量, 可见下丘脑组织β-Ep含量显著减少, 可能系MEL促进β-Ep释放引起组织含量降低。这些工作与本研究结果是吻合的。脑内β-内啡肽能胞体存在于下丘脑弓状核等,弓状核的β-内啡肽纤维沿第三脑室壁终止在PAG等部位, 其末梢释放的β-Ep通过作用PAG而在内源性镇痛系统中发挥着重要作用［14］。因此, MEL通过促进β-Ep的释放,作用于PAG等内源性镇痛系统, 可能是其发挥镇痛效应的中枢机理之一。

但是, 关于MEL作用的中枢通路以及MEL受体表达细胞与阿片肽阳性神经元之间的关系,尚未见直接的<