摘要：本文测定了兔膈肌钙释放单位中骨骼肌型DHPRα1-亚单位和RyRs的mRNA与蛋白表达水平, 探讨了兔膈肌钙释放单位的结构组成特征。采用RT-PCR、 原位杂交和免疫组织化学技术, 分别测定兔膈肌骨骼肌型 DHPRα1- 亚单位和RyR1、RyR2及RyR3的 mRNA 与蛋白表达。结果显示, 兔膈肌可见较高水平的骨骼肌型α1-亚单位和RyR1 mRNA 与蛋白表达; 较低水平的RyR3 mRNA与蛋白表达。表明兔膈肌钙释放单位由骨骼肌型 DHPR、 RyR1和RyR3构成, Ca2+释放可能具有变构耦联和CICR耦联两种形式, RyR3的存在可能是膈肌ECC依赖于细胞外Ca2+的主要原因。在横纹肌细胞中, 钙信号依赖于两个膜结构中的钙释放单位, 即细胞膜中的二氢嘧啶受体(DHPR)和肌浆网(SR)膜中的Ryanodine受体(RyR)的信息交流［1,2］。近年来发现, 骨骼肌和心肌的 DHPR 和RyR有不同的亚型分布, 钙释放单位的耦联模式存在着明显差异［1～3］。在骨骼肌中, 骨骼肌型 DHPR 通过直接耦联或／和变构耦联效应导致RyR1释放Ca2+; 而心肌则通过心肌型DHPR, 以Ca2+致Ca2+释放(CICR)方式使RyR2激活。尽管膈肌属于骨骼肌, 但它显示出心肌和非呼吸骨骼肌的一些特性: 一方面, 膈肌像心脏一样节律性地收缩终生; 另一方面, 膈肌受神经驱动, 有与骨骼肌一样工作的特征。一些研究已涉及到正常和病理状态下膈肌纤维的解剖和收缩性质改变［4,5］, 同时已知膈肌收缩依赖于细胞外Ca2+浓度, Ryanodine等能改变其收缩和Ca2+瞬时特征［6,7］。 但它为什么与其它骨骼肌不同, 收缩张力的产生需要细胞外Ca2+存在, 而这与钙释放单位有何关系等问题研究较少。基于这个目的, 本实验测定了膈肌骨骼肌型DHPRα1-亚单位和RyRs mRNA 和蛋白水平的表达形式, 以探讨膈肌钙释放单位的结构组成特征。

1材料和方法

1.1材料及主要试剂日本大白兔6只, 年龄4～6月, 体重2.0～2.5 kg, 雌雄不拘, 处死即取膈肌, 用同一标本分别进行RT-PCR、原位杂交和免疫组织化学检测。总RNA提取试剂盒、脱氧核糖核苷酸(dNTP)和地高辛末端引物标记试剂盒由德国宝灵曼公司提供; RNA酶抑制剂(RNAase inhibitor)、 DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)和寡脱氧胸苷酸引物(Oligo DT15)由 Promega公司提供; 逆转录酶(Reverse tran～scriptase, MMLV) 由GIBCO公司提供; RyR1、RyR2、RyR3和骨骼肌型DHPRα1-亚单位寡核苷酸引物分别由中国科学院上海细胞研究所和癌基因研究所合成; PCR分子量标记物(PCR marker)由华美生物工程公司提供。RyR抗血清由F.Anthony Lai博士惠赠(From The Medical Research Council, National In～sti～tute for Medical Research, United Kingdom), 含RyR1和RyR3抗体; RyR1单克隆抗体由Kevin P.Campbell博士惠赠(From The Department of Phar～ma～col～ogy, School of Med～icine, University of Washington, USA); 骨骼肌型DHPRα1-亚单位单克隆抗体由William A.Catterall惠赠(From the Department of pharmacology, school of Med～icine, University of Washington, USA)。原位杂交有关试剂: 蛋白酶K、去离子甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、变性鱼精DNA、DTT等分别购自Sigma和华美生物工程公司。试剂的配制参照有关文献［13］。

1.2方法

1.2.1RT-PCR总RNA提取参照宝灵曼公司总RNA提取试剂盒进行, cDNA第一链的合成和PCR按分子克隆等方法进行［8, 9］。步骤为:(1)新鲜膈肌100 mg, 置1 ml总RNA提取裂解液中, 剪碎、匀浆; (2) 4℃离心12?000 g×10 min, 取上清, 室温放置1～3 min; (3) 加氯仿0.2 ml, 用力振荡15 s, 室温置放反应15 min; (4) 4℃离心12?000 g×10 min, 小心取上层无色上清液至新的EP管中, 加异戊醇0.5 ml, 翻转混匀, 室温放置5～10 min; (5)4℃离心12?000 g×10 min, 弃上清, 加75%乙醇1 ml, 滚动EP管漂洗RNA沉淀; (6)4℃离心7?500 g×5 min, 弃上清, 室温干燥5～10 min, 加50 μl DEPC处理过的去离子双蒸水, 55～60℃水浴孵化10～15 min; (7)UV-2201型紫外分光光度计测总RNA浓度, 重复测定3次, 取均值为测量值。按下式计算总RNA浓度: 总RNA浓度(μg/ml)=A260×稀释倍数×40。

1.2.2cDNA第一链的合成取总RNA溶液1 μg, 于冰上加以下试剂: (1) 1 μl Oligo DT15, DEPC水加至10 μl, 轻轻混匀, 70℃孵育10 min, 冰浴2 min; (2) 5×synthesis buffer (Mg2+ 25 mmol) 4 μl; 10 mmol dNTP 1 μl; 0.1 mol DTT 2 μl; MMLV (100 U/μl) 1 μl; RNAase抑制剂 (40 U/μl) 1 μl, 轻轻混匀, 37℃反应90 min, 95℃ 10 min灭活逆转录酶, 冰浴10 min, 完成cDNA链合成。扩增RyR1、RyR2、RyR3和DHPRα1-亚单位特异性片段的同时, 对应扩增β-actin作为外参照, 同样引物一式三管。 RyR1、RyR2和RyR3引物根据Tunwell等［10］和Bennett等［11］设计的寡核苷酸序列加以修改(RyR1: forward primer: 5′-AGAT～CTGG～AAGTT～CGGGG～TCATCTT-3′, nu～cle～otides 14327-14351; Reverse primer: 5′-CAGCTG～GTCCTC～GTAT～GGCTT～GCGG-3′, nu～cle～otides 15084-15018; RyR2: forward primer: 5′-TCCA～TTCTTG～GACA～CTAT～ACA～ACTT-3′, nu～cle～otides 14208-14232; Reverse primer: 5′-TAGC～TGGT～CTTC～ATACT～GTT～TCC～GG-3′, nu～cle～otides 14880-14904; RyR3: forward primer: 5′-GAT～GGG～CTTT～ATAT～TACAG～AAC～AAC-3′, nu～cle～otides 13864-13888; reverse primer: 5′-CAC～CTTT～CCT～GGTA～CATC～TTCC～ACT-3′nu～cle～otides 14535-14558), 分别特异性地扩增出691 bp RyR1、696 bp RyR2和694 bp RyR3片段。骨骼肌型DHPRα1-亚单位引物根据Ray等［12］设计的寡核苷酸序列(Forward primer: 5′-GTG～CGAC～AGGG～GAGGC～GTG～GCAAC-3′, nu～cle～otides 3956-3979; Reverse primer: 5′-TGGA～CCTGC～TCA～AGT～TCCG～ATA～GAC-3′, nu～cle～otides 4193-4217), 可特异性地扩增出261 bp骨骼肌型DHPRα1-亚单位片段。β-actin引物根据宝灵曼公司提供的寡核苷酸序列(Forward primer: 5′-CCAA～GGC～CA～ACC～GCG～AGAA～GAT～GAC-3′; reverse primer: 5′-AG～GGT～ACAT～GGTGG～TGC～CGCCA～GAC-3′), 可特异性地扩增出587 bp β-actin片段。PCR反应体系为50 μl, 同样的引物一式三管: (1) cDNA 2 μl; 10×PCR buffer 5 μl; 15 mmol Mg2+ 5.8 μl,终浓度1.75 mmol MgCl2; 10 mmol dNTP 4 μl, 终浓度 0.2 mmol; 上游引物 2 μl, 终浓度0.4 μmol; 下游引物 2 μl, 终浓度0.4 μmol。加DEPC去离子双蒸水至终体积49 μl。 (2) 95℃ 5 min变性后立即冰浴, 加Taq酶(5 U/μl) 1 μl。反应体系建立后, 置于PCR扩增仪中。 变性、退火和延伸等反应条件分别为: 94℃ 2 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1 min×1 cycle; 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1 min×30 cycles; 72℃ 10 min。

PCR反应完成后, 取5 μl反应液在1.5%琼脂糖凝胶电泳, 同时以PCR marker为分子量标准。电泳电压50 V。电泳完成后于紫外灯下照相。PCR marker分子量标记物片段大小分别为: 1543、 944、 695、 515、 377和237 bp。对RT-PCR电泳产物黑白照片条带进行密度扫描, 测其积分光密度值(OD)。

1.2.3原位杂交和免疫组织化学技术寡核苷酸探针为RyR1、RyR2、RyR3和DHPRα1 的下游引物寡核苷酸片段, 探针标记、原位杂交和免疫组织化学按蔡文琴等方法进行［13］ 。用重庆大学Tiger 920G细胞图像分析软件进行图像分析, 分别随机测量每个标本的10个面积着色深度的积分光密度值(OD), 取均值为测定值。

1.3统计分析按基本统计方法处理相应数据。

2结果

2.1膈肌钙释放单位中骨骼肌型DHPRα1-亚单位、RyR1-3 mRNA 表达

2.1.1RT-PCR膈肌中可见明显骨骼肌型DHPRα1-亚单位、RyR1和RyR3的 mRNA 表达; 以RyR1 mRNA 表达量加上RyR3 mRNA 表达量为RyR mRNA 总表达量; RyR1表达较高, RyR3表达较低, 未检测到RyR2表达。DHPRα1-亚单位、 RyR1和RyR3 ～mRNA 的表达。

2 .1.2原位杂交骨骼肌型 DHPRα1-亚单位和RyR1 mRNA 表达较高, 在胞浆内可见均匀分布紫蓝色颗粒, RyR3 表达较低, 仅在胞浆内见到稀疏的紫蓝色颗粒, RyR2 未在胞浆内见到稀疏的紫蓝色颗粒。 骨骼肌型 DHPRα1- 亚单位、 RyR1 和 RyR3 ～mRNA 的值分别为1?257.23±156.82、1?195.43±192.55和112.78±17.93。

2.2免疫组织化学

RyR棕褐色阳性颗粒位于胞膜下纵管和横管上, 分布较密集。RyR抗血清含RyR1和RyR3 抗体, 其结果为1?144.52±148.56; RyR1单克隆抗体结果为986.71±144.80; 骨骼肌型DHPRα1-亚单位呈现棕褐色阳性颗粒位于胞膜和T管上, 分布较密集, 结果为1184.90±141.22。

3讨论

最近发现脊椎动物中DHPRα1-亚单位和RyR亚型有不同的分布, 提示其E-C耦联有比仅从脂质双脂层或～45Ca2+负载SR囊的心肌和骨骼肌的电流记录推论更为复杂的机制。通常认为, 哺乳类组织中心肌表达心肌型DHPR和RyR2亚型, 骨骼肌表达骨骼肌型DHPR和RyR1亚型以及RyR3亚型存在于脑和平滑肌内。然而, 较为敏感的 mRNA 分析和特异性的亚型抗原测定发现大部分组织或细胞中存在一个以上的RyR亚型和DHPR亚型, 包括肌肉、腺体和脑［14,16］。本实验的RT-PCR和原位杂交结果支持这些分析, 同时也证明了原位杂交方法对 mRNA 的检测既敏感, 又具有局部定位的特征。目前发现心肌表达心肌DHPR、RyR2和RyR3, 而骨骼肌表达了骨骼肌型DHPR、心肌型DHPR、RyR1和RyR3。骨骼肌和膈肌中RyR3的相对含量似乎与它们对细胞外Ca2+的