摘要：铃声刺激诱发惊厥, 原位杂交法检测遗传性听源性癫痫易感大鼠(P77PMC)一次与多次惊厥发作对杏仁核内胆囊收缩素(CCK) mRNA含量的影响。结果发现:(1)惊厥未发作组大鼠杏仁核单位面积内的CCK mRNA 阳性神经元数(No/0.01 mm2)较少, 为8±1; (2)惊厥发作一次组大鼠杏仁核单位面积内CCK mRNA阳性神经元数显著增加, 发作后30 min时达到峰值, 为58±5 (P＜0.01), 但是2 h后迅速降为正常, 为9±2 (P＞0.05);(3)惊厥多次发作组大鼠在惊厥发作后30 min时, CCK mRNA阳性神经元数亦显著增加, 为22±3 (P＜0.01),但明显低于惊厥发作一次组大鼠(P＜0.01), 1 h即恢复正常, 为9±3 (P＞0.05)。结果表明, 惊厥发作后P77PMC大鼠杏仁核内CCK mRNA含量呈现迅速而短暂增加的特点, 表明CCK mRNA参与惊厥的急性发作过程, 提示CCK mRNA在惊厥发作早期阶段发挥了重要的抗惊厥作用。脑肠肽是研究肽类抗痫药物中最有希望的一类神经肽, 胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)作为脑内含量最高的一种脑肠肽,已被许多实验证实是一种内源性的抗惊厥物质。在许多动物惊厥模型如电点燃、化学药物点燃模型中发现惊厥发作后大脑皮层和海马内CCK样免疫活性物质和CCK mRNA含量增加［1］, 而杏仁核内的变化却并不一致［3］。为进一步探讨惊厥发作时杏仁核内CCK mRNA的变化规律, 揭示遗传性听源性点燃与杏仁核的关系,本研究在建立听源性惊厥动物模型后, 采用原位杂交结合体视学分析, 观察并比较一次与多次惊厥发作对杏仁核内胆囊收缩素(CCK)mRNA含量的影响。

实验选用遗传性听源性癫痫易感大鼠(P77PMC, 雄性,由北京医科大学实验动物部提供),随机分为3组: (1)惊厥未发作组(n=5)作对照;(2)惊厥发作一次组(n=20); (3)惊厥多次发作组(n=20): 每日上、下午各诱发惊厥发作一次, 连续诱发2 d。2、3两组大鼠分别在惊厥后30 min(n=5)、1 h(n=5)、2 h(n=5)、24 h(n=5)断头取脑。将大鼠置于80 cm×60 cm×60 cm的透明隔音箱内, 以100 dB铃声刺激60 s诱发惊厥。大鼠惊厥发作表现为狂奔20～30 s, 经10～20 s间歇期, 再次狂奔10～20 s, 继之全身抽搐, 角弓反张, 40～60 s后抽搐停止。惊厥发作按文献［2］方法评分。即: 行为无改变者记0分; 仅有狂奔者记2分; 铃声刺激后出现两个阶段的狂奔跳跃伴面部阵挛者记5分;狂奔跳跃后随即出现前肢抽搐者记8分; 狂奔跳跃后继之全身抽搐,呈角弓反张状态者记9分。本实验选用惊厥发作评分为8分以上的大鼠为研究对象。各组大鼠用水合氯醛麻醉,经升主动脉灌注生理盐水及4%多聚甲醛和0.3%含饱和苦味酸的磷酸缓冲液(PB, pH 7.4, 0.1 mol/L)。将大鼠头部固定于立体定位仪上, 按照Paxinos-Waston图谱(1982)定位并标记杏仁核,定位坐标为: A: -2.3 mm, R或L: 5.0 mm, H: 6.7 mm。剥离颅骨暴露脑组织,按杏仁核标记点垂直切断大脑。取脑组织在4%多聚甲醛溶液中固定2 h, 浸入20%蔗糖磷酸缓冲液至组织块下沉。所用质粒PUC13来自Dixon J.E.教授实验室,内含577碱基对pCCK cDNA。酶切位点为EcoR I和Hind Ⅲ。实验采用氯化钙法进行质粒的转化, 转化工程菌为HB101。碱裂解法大量制备质粒,分别用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ内切酶对插入片段进行酶切。采用“V型槽”DNA回收法回收目的基因。用Dig-随机引物标记法对cDNA探针进行标记。脑组织以OCT包埋,在杏仁核切面行冰冻切片, 片厚20 μm, 切片置于PBS缓冲的4%多聚甲醛中固定10 min后进行原位杂交, 具体操作参照Young的方法［4］。 杏仁核内的CCK mRNA阳性神经元密度以0.01 mm2内的阳性神经元数表示(10×10方格测试系统, 显微镜下记数), 每例记数5张切片, 为避免记数时主观因素的影响,每张脑片定点记数5个视野, 取其平均值, 各视野随机选择, 互不重复。

实验结果以均数±标准误表示,比较两组间结果时采用组间均数t检验,以P＜0.05作为差别有显著性的标准

主要实验结果如下:

1.惊厥未发作组大鼠杏仁核内CCK mRNA含量较少

惊厥未发作组大鼠杏仁核单位面积内CCK mRNA阳性细胞数(No/0.01 mm2)较少(8±1) , 散在分布于杏仁核各区,胞质内蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物量少, 着色浅, 与背景反差小, 胞体直径约10～30 μm; 细胞形态以圆形为主。

发作组大鼠杏仁核内CCK mRNA含量较少

惊厥未发作组大鼠杏仁核单位面积内CCK mRNA阳性细胞数(No/0.01 mm2)较少(8±1), 散在分布于杏仁核各区,胞质内蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物量少, 着色浅, 与背景反差小, 胞体直径约10～30 μm; 细胞形态以圆形为主。

2.惊厥发作一次组大鼠杏仁核内CCK mRNA呈迅速而短暂增加的特点

惊厥发作后的30～60 min内, 杏仁核内CCK mRNA阳性神经元密度较惊厥未发作大鼠显著增高, 2 h后降为正常。惊厥后30 min、1、2和24 h各时间段阳性神经元密度(No/0.01 mm2)分别为58±5 (P＜0.01), 28±4 (P＜0.01), 10±3 (P＞0.05), 9±2(P＞0.05)。CCK mRNA阳性细胞着色深, 轮廓清楚, 与背景对比清晰,反差明显。胞质内充满蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物。细胞形态以圆形为主。胞体直径约10～50 μm, 均匀分布于杏仁核各个部分。

3.惊厥多次发作大鼠杏仁核内CCK mRNA含量明显低于惊厥发作一次大鼠

惊厥后30 min阳性神经元密度(No/0.01 mm2)为29±4, 较惊厥未发作组显著升高(P＜0.01),但与惊厥发作一次大鼠比较明显减少(P＜0.01); 随后迅速降为正常, 1、2和24h各时间段阳性神经元密度(No/0.01 mm2)分别为, 9±3(P＞0.05), 8±3 (P＞0.05), 7±2 (P＞0.01) 。CCK mRNA阳性细胞着色较深, 轮廓清楚, 与背景对比清晰,反差较明显。细胞形态为圆形, 胞体直径约10～45 μm, 均匀分布于杏仁核各个部分(图2F～H, 见图版Ⅲ)。

有学者在杏仁核电点燃癫痫模型和电惊厥癫痫模型(ECS)中发现, 单次点燃杏仁核致癫痫发作后, 杏仁核内CCK mRNA含量降低30%～58%,而在连续多次点燃致癫痫发作后, 杏仁核内CCK mRNA含量升高; 电惊厥癫痫(ECS)对杏仁核内CCK mRNA含量没有影响［3］。本实验与其主要不同点是:（1） 所选动物模型不同。实验选用的P77PMC大鼠有先天性惊厥发作倾向, 而许多癫痫病患者具有遗传病史,因此选用P77PMC大鼠对揭示与遗传有关的人类癫痫发病机制有重要的意义。（2） 结果不同。实验单次惊厥发作和多次发作后杏仁核内CCK mRAN含量均升高,而在电点燃杏仁核致癫痫发作大鼠, 单次点燃组杏仁核内CCK mRNA含量降低, 多次点燃组升高; ECS对杏仁核内CCK mRNA含量没有影响。结果表明,惊厥发作后杏仁核内CCK mRNA含量呈迅速而短暂性增加的特点, 因为CCK mRNA含量升高维持仅1 h。尽管目前尚不清楚产生这一现象的原因, 但显然表明CCK mRNA与惊厥急性发作有关, CCK mRNA参与了惊厥的早期发作过程。文献报道, CCK可减轻或延迟癫痫的发作［3］, CCK对大鼠大脑皮层神经细胞具有保护作用,它还能显著促进大脑皮质突触体及胚胎脑皮质神经细胞释放GABA, 从而使脑神经细胞痫性放电减少［5］。据此认为, 本实验惊厥发作后杏仁核内CCK mRNA含量增加可发挥如下作用: (1)减轻或延迟癫痫发作; (2)机体为防止癫痫发作时, 由于缺氧造成细胞的水肿、变性及坏死是一种自我保护作用; (3) cCK通过促进抑制性神经递质GABA的释放, 改变癫痫发作的阈值, 抑制脑细胞异常放电而发挥其抗痫作用。

本实验另一个有趣的发现是惊厥多次发作的大鼠杏仁核内CCK mRNA含量较一次发作组显著降低, 说明大鼠杏仁核内CCK mRNA含量并非随着惊厥发作的频率及时间的增加而相应增加, 相反, 经过反复多次的慢性惊厥发作后, 杏仁核内CCK mRNA的转录速度反而明显减慢。这进一步证明CCK mRNA主要参与惊厥的急性发作过程, CCK mRNA可能在惊厥发作的早期发挥抗惊厥作用。

corresponding author. Tel: 0532-3838480-3759; E-mail: nyr@public.qd.sd.cn倪宏(青岛大学医学院生理教研室)

徐珞(青岛大学医学院生理教研室)

唐明(青岛大学医学院生理教研室)

王守彪(解剖教研室, 青岛 266021)

参考文献

［1］Gruber B, Greber S， Sperk G. Kainic acid seizures cause enhanced expression of cholecystokinin-octapeptide in the cortex and hippocampus of the rat. synapses, 1993, 15: 221～228.

［2］Zhao D. Long term effects of febrile convulsion on seizure susceptibility in P77PMC rat resistant to acoustic stimuli but susceptibile to kainate-induced seizure. Exp Neurol, 1985, 88: 688～691.

［3］Zhang LX, Mark A, Smith SYK et al. Changes in CCK mRNA expression after amygdala kindled seizures: an in situ hybridzation study. MolBrain Res. 1996,35 (1-2): 278～284.

［4］Young III WS． In situ hybridization histochemical detection of neuropeptide mRNA using DNA and RNA probe. Meth Enzymol, 1989, 168: 702～709.

［5］Crawley JN, Corwin RL. Biological actions of cholecystokinin. Peptide,1994, 15 (4): 731～755.

received 1999-01-12Revised 1999-09-15