摘要：采用行为观察和生化检测相结合的方法, 在过去工作的基础上,研究了12月龄和18月龄小鼠学习记忆能力的变化和18月龄小鼠四个脑区(海马、大脑皮层、四叠体和小脑)突触体内［Ca2+］i的水平,同时还比较了老年记忆保持良好组与记忆障碍组小鼠的脑钙水平。 结果表明, 随着年龄的增长, 小鼠的学习记忆能力显著下降,上述脑区(除大脑皮层外)突触内［Ca2+］i均明显升高, 其中老年记忆障碍小鼠脑钙水平升高最为显著。 提示,小鼠衰老性记忆障碍可能与其脑突触体内［Ca2+］i的超载有关。近年来, 关于Ca2+与衰老的关系日益受到重视。 Ca2+在细胞的多种生理生化反应过程中起着重要的信使或耦联作用。 学习记忆是脑的高级功能,是建立在神经元之间的信息传递及细胞内各种生理生化反应基础上的， 而Ca2+与学习记忆的关系极为密切［1,2］。 我们过去的研究表明, 用海马定位微量注射的方法,人为地造成小鼠海马突触内Ca2+超载, 能显著损伤小鼠的学习记忆能力［3］, 还证明不同月龄的小鼠,其学习记忆能力与脑突触体内的［Ca2+］i有平行相关性［4］。 由于动物或人在自然衰老过程中, 其学习记忆能力呈增龄性下降已众所周知［5,6］, 因此我们推测,动物或人的衰老性记忆障碍可能与学习记忆相关脑区突触体内［Ca2+］i的变化有关。本文在我室对不同月龄小鼠学习记忆力与其脑突触体内的［Ca］变化的相关性研究的基础上［4］,不仅系统地研究了在整个自然衰老过程中小鼠学习记忆力与其脑突触体内变化的相关性, 而且还比较了老年记忆良好组与老年记忆障碍组小鼠的脑钙水平,以探讨衰老性记忆障碍与脑突触体内钙离子水平的相关性, 为衰老性记忆障碍的研究提供了基础资料。

实验采用由南京大学动物房提供的昆明品系雄性小白鼠。 小白鼠在出生后1个月左右开始性发育成熟, 其寿命最长可达2年以上, 因此本研究观察的18月龄小鼠,可以视为典型的衰老小鼠。

Fura-2/AM为中国医学科学院药物研究所产品。 N-2-羟乙基哌嗪-N′-2′-乙烷磺酸(Hepes)为进口分装, 购自上海生化试剂商店。 aR-CM-MIC阳离子测定系统为美国Spex公司产品, 配套使用的Diapho-TMD型荧光倒置显微镜为日本Nikon公司产品。

分别用下述两种学习行为模型检测12和18月龄小鼠的学习记忆能力: 以三等分辐射式迷宫(即Y-迷宫)作为分辨学习(discrimination learning)能力的检测模型［7］, 灯光信号表示安全区, 安全区方位按随机表变换。 灯暗示3 s, 电击小鼠足部(电击参数为0.3 mA)。用分段训练法, 即每训练10次让小鼠休息1 min, 以连续10次训练中有9次(90%)正确反应定为学会标准, 训练在1天内完成,记录每个小鼠在Y-迷宫中达到学会标准所需训练次数。 训练次数越少说明小鼠学习能力越强或学习速度越快, 观察上述5种不同月龄小鼠的分辨学习能力的动态变化;用1次性被动回避反应模型检测小鼠在上述2种月龄时的记忆保持力的变化［8］。 以电击后24 h的步入潜伏期(step-through latency, STL)作为记忆保持力的指标(电击参数为0.3 mA, 50 Hz, 5 s), STL越长, 说明记忆保持越好。 检测以300 s为限, 凡STL大于300 s者, 均视为记忆保持良好。

待上述测试小鼠行为反应消退(10 d)后, 将小鼠拉断颈椎处死, 迅速分离海马、大脑皮层、中脑四叠体和小脑, 分别称重后进行组织匀浆。 匀浆后,再按本室过去报道的方法制备突触体, 测定和计算突触体内游离［Ca2+］i［4］。

对分辨学习能力的检测结果进行t检验; 记忆保持能力用非参数检验法进行统计处理; 突触体内［Ca2+］i的测定经计算机软件处理后, 再进行t检验, 以nmol/L为单位。

我们过去的研究表明, 与1月龄小鼠相比, 3月龄和6月龄小鼠分辨学习能力已呈明显衰退［4］, 本研究中, y-迷宫检测12月龄和18月龄小鼠的分辨学习能力的实验结果表明, 与1月龄相比,这两种月龄小鼠达到学会标准所需训练次数继续随月龄增大而极显著增多(P＜0.01),其中18月龄小鼠达到学会标准所需训练次数竟比1月龄小鼠多1倍以上（分别为59.38±10.62和24.00±6.78）。 可见在自然衰老过程中,小鼠的分辨学习能力呈衰老性下降, 18月龄时, 小鼠的分辨学习能力已严重衰退。

不同月龄小鼠记忆保持力的检测结果表明, 与1月龄组相比, 18月龄小鼠电击后24 h的STL显著缩短(两者的中位数分别为109.25 s和300 s, p＜0.05); 12月龄与1月龄相比, 则没有统计学差异, 但由中位数可以看出, 其STL值也有下降的趋势(两者的中位数分别为279.4和300 s),说明小鼠的记忆保持力也呈衰老性减退, 同时也说明在衰老过程中, 小鼠的记忆保持力比分辨学习能力衰退得晚。

鉴于本研究的12月龄小鼠与我室以前研究的3, 6月龄小鼠相比, 其学习记忆能力没有显著性变化, 故实验只选择18月龄(老年期)组进行脑钙水平测定,并以1月龄小鼠所测各脑区突触体内［Ca2+］i水平为对照, 所测各脑区突触体内［Ca2+］i水平结果显示, 与1月龄(青年期)小鼠相比,18月龄(老年期)小鼠除大脑皮层突触体内无明显变化外(P＞0.05), 海马、四叠体和小脑突触体内［Ca2+］i均极显著地升高(P＜0.001);而我室过去的研究表明, 6月龄组与1月相比, 除海马突触体内［Ca2+］i极显著地升高(P＜0.001)外,其他三个脑区突触体内［Ca2+］i无明显变化(P＞0.05)［4］。 这一结果表明,衰老小鼠多数学习记忆相关脑区突触体内的［Ca2+］i水平均极显著地升高(P＜0.001)。

我们在行为观察中发现, 各个小鼠的衰老速度很不一致, 其学习记忆能力的衰退有很大个体差异, 18月龄小鼠中, 有些个体已呈严重的学习记忆障碍,而有些则仍表现为记忆良好。 这样就有必要探讨记忆障碍与脑突触体钙水平的直接关系, 为此通过行为检测将老年小鼠分为记忆障碍组与记忆良好组。 如同上述,以青年小鼠(1月龄)电击后24 h的STL值(中位数300 s)作为标准, 将老年小鼠中STL值高于300 s视为记忆保持良好, 反之将STL值低于100 s作为记忆障碍小鼠, 并将STL介于100 s与300 s之间的小鼠视为记忆正常。比较正常老年、老年记忆障碍和老年记忆良好三组小鼠四个不同脑区突触体内［Ca2+］i, 其结果见图1。 结果显示, 与青年小鼠相比,老年记忆良好组只有四叠体和小脑内［Ca2+］i极显著升高(P＜0.001), 其他两脑区都无明显变化, 正常老年组除大脑皮层外,海马、四叠体和小脑内［Ca2+］i均极显著升高(P＜0.001), 而老年记忆障碍组四个脑区的［Ca2+］i全都极显著升高(P＜0.001)。 这一结果说明,衰老性记忆障碍与脑突触体内游离钙水平过高密切相关。

图1.青年、老年记忆良好、正常老年和记忆障碍组小鼠四个主要脑区突触体内游离钙离子的浓度

fig.1.Intrasynaptosomal Ca2+concentration in four main regions of young control,old good memory,natural old and old impaired memory groups(mean,n=7～15).***P＜0.001, vs 1-month-old group. Values in the figure are means±SD. A, hippocampus; B, cerebal cortex; C, corpus quadrigemi; D, cerebellum.

结合我室过去的行为实验结果［4］, 本实验行为观察结果表明, 在自然衰老过程中, 小鼠的学习记忆能力呈衰老性的减退,这一结果与文献资料报道相一致［4,5］。 与行为观测结果相对应的是, 在衰老过程中,与学习记忆功能密切相关的主要脑区-海马和小脑突触体内［Ca2+］i均呈显著性升高, 尤其是海马, 其突触体内［Ca2+］i升高是一个持续的过程;老年记忆障碍组其四个主要脑区突触体内［Ca2+］i与青年小鼠相比, 升高也极为显著。 这些结果表明, 衰老性记忆障碍可能与脑突触体内游离钙离子超载有关,同时也说明海马是脑老化过程中易受伤的一个脑区［10］。 另外, 本室王良斌等人以前的研究曾表明, 老龄大鼠大部分脑区（海马,皮层和四叠体）突触体内［Ca2+］i均显著升高, 特别是海马突触体内［Ca2+］i的升高极为显著, 而小脑突触体内的［Ca2+］i却呈相反趋势［11］,其结果虽然与本研究不尽相同, 但都说明脑衰老可能与脑突触体内［Ca2+］i浓度的异常变化有关,同时也说明衰老性记忆障碍与脑突触体内钙离子水平的相关性研究是一个十分复杂的课题, 值得进一步研究。

鉴于Ca2+是化学性突触传递的重要信使, 起着调节细胞功能的作用, 细胞内Ca2+浓度的过高或过低都会影响细胞的功能。有作者发现衰老动物脑锥体细胞内Ca2+介导的后超极化明显延长［12］。 衰老动物脑细胞内线粒体数目减少、体积变大, 线粒体或突触体摄取Ca2+的能力下降,从而导致胞内钙缓冲能力发生改变, 结果造成脑细胞内Ca2+的超载［13］。 并且有文献报道, Ca2+超载后, 过剩的Ca2+沉积于线粒体内, 干扰呼吸链反应,消耗大量的ATP, 且Ca-Mg2+-ATP酶, Na2+-K2+-ATP酶等活性受到抑制, 产生大量的氧自由基, 对细胞造成损伤［5］; 同时,胞内高浓度的Ca2+还可激活核内切酶, 导致核小体间DNA断裂, 并释放大量的DNA碎片, 最终使细胞失去活性［14］。在含有神经纤维缠结的衰老细胞和早老性痴呆的成纤维细胞内均见有钙的积累［2］; 本室过去的单个神经细胞观察研究也发现, 胞内Ca2+超载对神经细胞具有毒性作用,造成细胞肿胀乃至破膜死亡［15］。 另外, 本室过去的行为研究也表明, 人为地造成小鼠海马突触内Ca2+超载, 能显著地损伤小鼠的学习记忆能力,并引起脑内突触界面一些结构参数的改变［3］。 由此我们推测, 小鼠衰老性记忆障碍的脑内突触机理之一, 可能是由于突触体内Ca2+严重超载, 使神经元代谢受阻,能量耗竭, 神经信息传递受到严重影响, 尤其是海马这一与学习记忆密切相关的脑区发生严重钙超载时, 可能会导致神经信息传递异常,从而进一步影响整个海马区的信息处理过程, 最终在行为上表现为衰老性记忆障碍。 当然,<