摘要：为了研究受损背根节神经元的放电型式与其对钾离子通道阻断剂四乙基胺(tetraethylammonium, TEA)反应敏感性的关系, 在大鼠背根节慢性压迫模型上记录单纤维自发放电。这些自发放电有周期和非周期两种型式, TEA (2 mmol/L)分别引起２７.３％的周期放电神经元和９３.２％的非周期放电神经元的放电增加(P＜0.01)。非周期放电神经元对不同浓度的TEA的反应均比周期放电神经元大(P＜0.01)。当5个对TEA 不敏感的周期放电神经元转化为非周期放电后, 对TEA出现明显的反应。在阵发放电中, TEA使非周期性的阵发放电间期明显减小(P＜０.０１), 而周期性的串放电峰峰间期基本不变(P＞0.05)。在阵发放电序列中测出非稳定周期轨道, 说明阵发放电中具有确定性混沌。结果表明, 具有混沌特性的非周期放电神经元比周期放电神经元对TEA反应敏感。初级感觉神经元在受到损伤后对外界刺激变得非常敏感[1～3]。这种敏感性的变化与神经元的受体、通道以及细胞内信使等的变化有关[4～6]。我们以往的工作发现, 受损的背根节 (DRG) 神经元对去甲肾上腺素(NE)反应的敏感性与其放电型式相关, 非周期放电神经元的反应比周期放电者更为敏感, 并推测这种“非周期敏感”现象可能与放电的混沌特性有关[7]。为了证明“非周期敏感”这一现象的普遍性, 本文选用与NE作用机制不同的钾通道阻滞剂四乙基铵(tetraethylammonium, TEA), 研究大鼠受损DRG神经元对TEA反应的敏感性与其放电型式之间的关系。

１材料和方法

1．1动物及手术 25只SD大鼠(200～300 g), 性别不拘, 由本校实验动物中心提供。DRG慢性压迫模型的制备方法 [1]: 在麻醉和消毒条件下, 暴露一侧第5腰椎(L5)的椎间孔, 将一L型不锈钢柱(长4 mm, 直径0.5～0.8 mm)插入L5椎间孔, 以形成对DRG的持续压迫。术后1～15 d, 在麻醉下进行腰部椎板切除术, 在L1～L2和L4～L5分别制备两个浴槽。在L4～L5浴槽内, 充分暴露受损的L5背根节, 并在背根节外周端切断脊神经, 防止外周感受器的传入冲动。在L4～L5浴槽内灌充35～37℃的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)或含有TEA (购自Sigma公司)的ACSF, 加药持续时间３ min, 加药间隔时间１０ min。在L1～L2浴槽内分离L5背根, 并用35～37℃的液体石蜡覆盖。在立体显微镜下, 从L5背根分离神经细束, 把外周端悬挂在白金丝电极上, 引导来自受损DRG神经元的放电, 并在示波器显示。根据放电的波幅和波形是否相同, 确定是否为单纤维放电, 如放电的波形为单相峰, 波宽较窄(＜1 ms)和纤维传导速度在4.4～38.5 m/s范围, 可确定是A类纤维[1, 3]。

1．2自发放电记录 在计算机上记录动作电位的峰峰间期(interspike interval, ISI)序列和放电密度直方图, 用ISI时间序列散点图显示放电型式。为了判定DRG神经元对TEA作用的敏感性, 以放电频率变化的百分数作为分析指标, 其计算公式为:

放电频率变化百分数=反应频率－基础频率[]基础频率×100%.基础频率为加TEA前3 min放电的平均频率, 反应频率为加TEA期间放电数变化到最大值1 min放电的平均频率[6]。数据以均数±标准误和百分率表示, 进行t检验和χ2检验。

1.3非稳定周期轨道(unstable period orbit, UPO)的测定 自发放电有一种阵发放电型式, 即放电与静息交替出现, 每串阵发放电的动作电位峰峰间隔(burst interspike interval)称为BISI。每次阵发放电作为一个放电事件, 两个放电事件之间的间隔(interevent interval)称为IEI。应用So等人提供的UPO检测方法和有关程序[7]测定IEI是否存在UPO, 该方法在延迟坐标嵌入相空间重构的基础上, 利用建立在系统局部动力学特性上的算法对数据进行变换计算。经过变换的数据点将集中在UPO的周围, 通过观察变换数据的分布峰就可以寻找UPO。 使用替代数据多重实现和极值统计的方法检验变换数据分布峰的统计显著性。

2结果

２.１受损DRG神经元的自发放电型式

在25例DRG慢性压迫模型上记录了91个神经元的自发放电。根据放电序列的ISI特征, 将放电型式分为两大类: 第一类为周期放电, 其ISI基本相等, 占有自发放电神经元总数的35.2% (32/91); 第二类为非周期放电, 其ISI显著不等, 占64.8% (59/91)。按ISI变化的特征又可将非周期放电分为三类[8～10]: (1) 阵发放电, 定义见上文, 占非周期放电神经元总数的74.6%; (2) 整数倍放电, 每个ISI为基础ISI的整数倍, 占11.9%; (3)不规则放电, ISI无规则变化, 占13.5%。

2.2受损DRG神经元对TEA的反应特征

受损DRG神经元在基础状态下自发放电频率相对稳定, 每分钟平均频率波动4.2%(0%～12.1%,n=91), 因此, 把TEA引起放电频率变化百分数超过15%作为该神经元对TEA有反应的标准。根据对TEA反应时的放电频率变化百分数的大小可将反应程度分为三种: 即放电频率变化百分数在15%～30%为弱反应,31%～100%为中等反应,大于100%为强反应。

2．3周期放电和非周期放电神经元对不同浓度TEA的反应

观察10个周期放电和阵发放电神经元对0.5、1、2和10 mmol/L TEA的反应, 其反应随TEA浓度的升高而增大。但是, 阵发放电神经元对1、2和10 mmol/L TEA的反应比周期放电神经元大(P＜0.01, 配对t检验)。

2．４同一神经元在不同放电型式状态下对TEA的反应性

5个周期放电神经元对TEA (2 mmol/L)无反应, 用含有高钙(5～10 mmol/L)的ACSF将其转化为非周期放电后, 这5个神经元对同一浓度TEA出现明显的反应, 用正常ACSF洗去高钙后, 这些神经元又恢复到原来周期放电, 对同一浓度TEA的反应随之消失。

2．５不规则阵发放电神经元的不同动力学成分对TEA反应

在阵发放电中IEI不规则, 应属非周期成分, BISI基本相等, 应属周期成分[11]。在32个阵发放电神经元的BISI在加TEA (2 mmol/L)前后分别为52.4±8.7和48.6±6.2 ms (P＞0.05); IEI在加TEA前后分别为862.2±189和298.9±42.2 ms (P＜0.01)。可见, BISI在加药时基本不变; 而IEI则显著减小。

2．6阵发放电的非线性动力学分析

3讨论

背根节慢性压迫模型提供了丰富型式的自发放电, 本文比较了周期与非周期两类放电型式的神经元对TEA反应的敏感性, 发现非周期放电神经元对TEA (2 mmol/L) 的反应率高、 反应强度大。 非周期放电神经元对不同浓度TEA的反应比周期放电者大。可见, 非周期放电神经元对TEA的反应比周期放电者敏感。在同一神经元观察到, 在周期放电状态下对TEA无反应, 而在非周期放电状态下对同一浓度的TEA有明显的反应; 此外, 阵发性放电的非周期成分IEI加药后明显减小, 而周期成分 BISI在加药前后基本保持不变。这些在同一神经元上观察到的“非周期敏感”现象可以排除不同神经元之间差异对反应的影响。我们曾根据非周期放电的受损DRG神经元对NE反应敏感的现象提出了神经元“非周期敏感”假说[7]。本实验又在受损DRG神经元对TEA的反应中再次证明了神经元的这一反应特征, 尽管这两种试剂的作用机制不同[6,13], 但神经元对其反应都表现为“非周期敏感”现象。提示“非周期敏感”可能是神经元活动的一个普遍特征。

已发现在受损初级感觉神经的自发放电倍周期中有分叉、 整数倍等混沌现象[9,14～16]。 本文在阵发放电的IEI中测出了构成混沌动力学的“骨架”UPO, 表明不规则的阵发放电也具有确定性混沌。混沌具有对系统参数轻微变化产生放大响应以及对初始条件敏感等基本特性[17]。本文观察到含有混沌的非周期放电神经元对TEA反应敏感的现象, 提示混沌的基本特性可能影响神经元的反应敏感性。 由于混沌现象广泛地存在于神经、循环、呼吸等各个系统中[18～20], “非周期敏感”现象是否反映了生物界反应活动的普遍性规律？我们正从不同的角度进行探索。

参考文献

[1]Hu SJ, Xing JL. An experimental model for chronic compression of dorsal root ganglion produced by intervertebral foramen stenosis in rat. Pain, 1998, 77: 15～23.

[２]Devor M, Janig W, Michaelis M. Modulation of activity in dorsal root ganglion (DRG) neurons by sympathetic activation in nerve-injured rats. J Neurophysiol, 1994, 71: 38～47.

[３]Xie YK, Zhang JM, Petersen M et al. Functional changes in dorsal root ganglion cells after chronic nerve constriction in the rat. J Neurophysiol, 1995, 73: 1811～1820.

[４]Waxman SG, Dib HS, Cummins TR et al. Sodium channels and pain. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 7635～7639.

[５]Zhang X, Wiesenfeld HZ, Hokfelt T. Effect of peripheral axotomy on expression of neuropeptide Y receptor mRNA in rat lumbar dorsal root ganglia. Eur J Neurosci, 1994, 6: 43～57.

[６]Xu H (徐 晖), Hu SJ (胡三觉), Han Y (韩 勇) et al. Protein kinase A mediated excitatory adrenergic effect on chronically compressed dorsal root ganglion neurons in rats. Acta Physiol Sin(生理学报), 1999, 51 (6): 615～622(in Chinese with English abstract).

[７]Hu SJ, Yang HJ, Jian Z et al. Adrenergic sensitivity of neurons with non-periodic firing