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1材料和方法
1.1脑核团的微量注射及脑电的记录成年Sprague-Dawley雄性大鼠(220±20 g), 用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g体重,ip)麻醉后,在海马CA1区(参照JF Konig and RA Klippel图谱, P 3.3, L/R 2.0, H 3.7)埋置注射套管(外径0.8 mm,内径0.4 mm), 4 d后开始实验。在颅骨表面相当于皮层感觉运动区的部位插入两根不锈钢针作为引导电极（针尖触及大脑皮层但不刺破硬脑膜）, 脑电信号输入电脑,用自制软件进行脑电信号的频谱分析, 计算40 s内1～30 Hz的总功率, 然后经外套管在CA1区微量注射0.5 μl不同浓度的SS或生理盐水(normal saline, NS), 观察并记录脑电及伴随的行为表现至150 min。
1.2红藻氨酸致痫模型及痫样活动的行为评级红藻氨酸(kainic acid, KA) 9 mg/kg或 5 mg/kg ip后,将处于自由活动状态的大鼠置于18 cm×35 cm×50 cm的鼠笼内, 观察行为改变3 h以上。癫痫发作分为: 0级, 行为正常; 1级, 咀嚼运动,即面部肌肉抽搐; 2级, 点头运动, 即颈部肌肉抽搐; 3级, 一侧前肢阵挛; 4级, 站立并双侧前肢阵挛; 5级, 双侧前肢阵挛加重, 失去平衡跌倒［7］。
1.3海马脑片的细胞外记录
1.3.1海马脑片的制备与灌流方法实验用180±30 g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠, 断头,开颅,取脑。 在低温(0～40C)人工脑脊液(ACSF)中分离出海马,切得片厚为400～500 μm的冠状海马脑片, 移入ACSF中, 连续通以95% O2和5%CO2的混合气体, 室温下孵育60～120 min后,移入记录小室。
记录小室为改良的浸没式小室, 容积约为1 ml, 脑片固定在两层尼龙网之间, 用恒流泵将含95%O2和5%CO2的ACSF以2～3 ml/min的速度通过小室, 其温度由控温仪控制在33.5±0.5℃。ACSF成分(mmol/L): NaCl 126, KCl 5, CaCl2 2, mgSO4 1.5, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glucose 10, pH 7.40。
1.3.2离体细胞外记录记录电极为尖端直径小于1 μm的单管玻璃微电极, 内充以含2%滂胺天蓝的0.5 mol/L的醋酸钠溶液, 直流阻抗在5～20 MΩ之间。在手术显微镜下,借助微电极操纵仪, 将微电极垂直插入海马CA1区锥体细胞层, 记录信号经阴极跟随输入微电极放大器(MZE-8201, Nihon Konden, Japan),显示在记忆示波器(VC-10, Nihon Konden, Japan)上, 同时用电生理仪对信号进行监听, 信号进一步经SMUP-PCI型生物信号处理系统（上海医科大学生理学教研室）处理,输入计算机, 对原始信号进行记录, 叠加成频率直方图。
为检验所记录的单位确在海马CA1区锥体细胞层, 实验结束后, 向记录电极的玻璃管内通以60 μA的阴极电流1 min, 泳出滂胺天蓝以标记记录部位,将海马置于4％多聚甲醛固定3 d, 用快速的Riboni染色法［8］, 在光学显微镜下, 参照JF Konig and RA Klippel图谱进行鉴定。
1.4药品及来源SS、 KA均为美国SIGMA公司产品, 生长抑素抗体(anti-somatostatin antibody,SSAB,滴度为1∶3.2万)由第二军医大学购买,青霉素(penicillin,PEN)钠盐或钾盐(80万单位/瓶）由上海先锋药业公司出品。
1.5 数据处理脑电总功率数据用均数±标准误表示,用配对t检验对数据进行统计分析。对给药后不同时间的痫样行为评级进行秩和检验。用药前后相同时段内海马脑片神经元的放电频率, 用均数±标准差表示,用配对t检验比较SS对PEN诱导的痫样放电的影响, 用方差分析中的Dunnett法检验SSAB对PEN诱导的痫样放电的影响。P＜0.05为有统计学差异。
2结果
2.1不同剂量生长抑素对大鼠皮层脑电的影响
大鼠一侧海马CA1区内注入0.5 μl NS或0.006 nmol SS, 给药后10～150 min内大鼠皮层脑电的频率及波形无异常变化,平均脑电总功率与给药前相比无显著差异(P＞0.05); 0.03～0.30 nmol的SS注入后10～30 min在皮层记录到痫样放电, 表现为典型的单个棘波、尖波及棘慢波, 以及短暂、 爆发性多棘慢波或不规则棘慢波, 给药后10～150 min, 各剂量组的平均脑电总功率与给药前相比显著升高(P＜0.05,图1),将0.006～0.15 nmol SS与给药后10～150 min的平均脑电总功率作相关分析, 相关系数r=0.9646(P＜0.01),说明SS在CA1区具有致痫作用, 该作用在一定的剂量范围内与剂量呈正相关。
2.2不同剂量生长抑素对大鼠行为的影响
为观察不同剂量SS对大鼠行为的影响, 在大鼠一侧海马CA1区微量注射不同剂量SS(0.006～0.30 nmol)或NS。实验分为以下3组:1.正常对照组(n=6); 2.NS对照组(n=6); 3.不同剂量SS (0.006～0.3 nmol)组。给予0.03(n=7)、 0.06(n=7)、0.09 (n=5)、 0.12(n=5)、 0.15 nmol(n=5) SS后20～30 min, 大鼠表现出咀嚼、 面颊抽动、甩头或甩尾等1～2级痫样活动; 给予0.30 nmol(n=8) SS, 大鼠除表现上述行为外, 还有步态不稳、 肌肉强直等表现, 轻微刺激即可触发其强直痉挛,痫样活动可持续120～180 min; 给予0.006 nmol(n=6) SS或NS, 大鼠行为与正常对照组相比无明显异常。
为观察不同剂量SS对KA诱导的大鼠痫样行为的影响, 实验分为以下6组(各组均为n=6): （1） KA (9 mg/kg,ip)对照组; （2） KA (9 mg/kg,ip)＋NS组; （3）KA (9 mg/kg,ip)＋不同剂量SS组; （4） KA (5 mg/kg,ip)对照组; （5） KA (5 mg/kg,ip)＋NS组;（6） KA (5 mg/kg,ip)＋不同剂量SS组。将致痫剂量的KA 9 mg/kg ip后1～2 min, 大鼠出现凝视状、 安静不动、 对触摸无反应,5～15 min后表现出咀嚼、 点头、 甩尾等1～3级痫样行为, 20～40 min后出现一侧或双侧前肢阵挛等3、 4级癫痫发作, 发作持续60～240 min以上; KA 9 mg/kg ip后15～25 min, 在海马CA1区微量注射0.03、 0.06、 0.09 nmol SS, 大鼠出现翘尾,肌肉强直, 全身阵挛, 翻滚等5级发作, 部分大鼠因癫痫大发作而死亡。将亚致痫剂量的KA 5 mg/kg ip, 大鼠仅表现出1～3级痫样行为, KA 5 mg/kg ip后15～25 min在CA1区给予不同剂量SS, 即刻引起3～4级(0.03, 0.06, 0.12 nmol)以及5级(0.15, 0.30 nmol)发作, 大鼠发作程度随SS剂量的不断增加而明显加重。在CA1区注射NS对两种剂量KA的痫样行为无影响(P＞0.05)。在KA ip后30、 60、90、 120、 150、 180 min的不同时间, 将各组大鼠的行为评级进行秩和检验, 证明两种剂量KA+SS(不同剂量)组与KA对照组相比差别有显著意义(P＜0.05)。
结果表明, SS在CA1区可诱发大鼠表现出痫样活动并加重KA诱导的大鼠痫样发作, 发作程度随SS剂量的增加而加重。
2.3生长抑素及其抗体对青霉素诱导的海马脑片痫样放电的影响
PEN钠盐或钾盐以2000 U/ml溶于ACSF中,存放灌流槽内, 经管道输送到脑片。SS、 SSAB及其他药液以一定浓度溶于上述PEN溶液中,输送到脑片, 用药时间为1 min。实验时, 先在CA1区找到PEN诱导的痫样放电单位, 待记录稳定后, 以灌流SS前15～20 min的平均放电频率作为对照。放电频率增加或减少30%以上被认为反应明显, 凡给SS后放电频率增加30%以上的为兴奋效应,放电频率减少30%以上的为抑制效应。每项实验后, 待放电频率恢复到原来的水平后再进行下一项目的观察。
在95个海马脑片上共记录了114个CA1区PEN诱导的痫样单位放电。灌流PEN 5 min左右,即可记录到主要呈单个高幅尖波放电和爆发性的成簇放电两种形式的痫样放电, 其电位幅度为0.3～0.5 mV, 放电时程为2～3 ms(单个放电)或5～10 ms(成簇放电), 放电频率为32.07±17.89 spikes/min。
2.3.1生长抑素对青霉素痫样放电的影响在CA1区, 10-12 mol/L SS (n=9)对PEN诱导的痫样放电的频率无显著影响(P＞0.05 );在CA1区记录的105个单位中, 灌流10-10、 10-8、 10-6 mol/L SS后2～5 min, 分别引起63.04%、 68.86%、40.91%单位放电频率增加, 即产生兴奋效应, 此效应持续5～15 min, 17.39%、 19.82%、 36.36%单位放电频率减少, 即产生抑制效应,持续10～25 min, 与灌流SS前相比有显著差异(P＜0.05), 19.57%、 16.22%、 22.73%单位放电频率无明显改变。因此,不同剂量SS诱导的兴奋单位占59.05%, 抑制单位占21.90%, 无效单位占19.05%（表1）, 提示SS的作用以兴奋为主。
