摘要：本文比较了心房钠尿肽(ANP)、 C-型钠尿肽(CNP)、 血管钠肽(VNP)抑制肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的效应。 用蛋白激酶C激动剂佛波酯(PMA)刺激体外培养大鼠PASMCs的增殖,以总蛋白含量和MTT比色OD值为指标, 观察三种钠尿肽对PMA刺激大鼠PASMCs增殖的影响。结果表明, PMA (10－9～10－7 mol/L)显著升高(P＜0.05) PASMCs的总蛋白含量和MTT OD值, VNP (10－8～10－6 mol/L)、 ANP和CNP(10－7～10－6 mol/L)均可显著降低(P＜0.05)PMA (10－8 mol/L) 刺激PASMCs的总蛋白含量和MTT OD值。 结果提示: pMA对大鼠肺动脉平滑肌细胞有促增殖作用, ANP、 CNP、 VNP均可抑制PMA刺激大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖, VNP的抑制效应最强。钠尿肽家族主要包括心房钠尿肽(ANP)、 C-型钠尿肽(CNP)、 脑钠尿肽(BNP)及人工合成的血管钠肽(VNP)等,早期对这些肽类生理作用的研究集中在其利钠利尿和舒张血管等方面, 而近年来发现它们还能抑制多种细胞的增殖, 但对VNP能否抑制细胞增殖、 与ANP、 CNP相比作用有何差别,目前尚无报道。 我们以往的实验表明, VNP可以防止在低氧条件下大鼠肺动脉高压的形成,抑制肺动脉高压大鼠肺动脉管壁增厚。本实验以体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)为研究对象, 比较了ANP、 CNP、 VNP对蛋白激酶C激动剂佛波酯(PMA)刺激PASMCs增殖的影响。

实验所用试剂、 仪器有胰酶和DMEM培养基(Gibco),胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所),VNP、 ANP和CNP (ANP和CNP均为人源性, vNP根据人源性ANP和CNP设计合成, 分别为27、 28、 22肽, 中国科学院上海生物化学研究所), PMA (Sigma),考马斯亮蓝G-250及噻唑蓝(MTT)(华美生物工程公司), 以及紫外分光光度计和酶联免疫检测仪(Beckman)。

主要药物配制方法VNP、 ANP及CNP: 将生理盐水配成10－4 mol/L母液, 4℃保存备用(以下除另有说明外, 保存条件均同此),实验时用培养液稀释。 PMA:二甲亚砜(DMSO)配成10-3 mol/L母液, 实验前用培养液稀释［7］。DMEM培养液: 按说明书配制, 用0.1 mol/L的盐酸调pH值至7.2～7.4。 0.125%胰蛋白酶: 生理盐水配制。MTT溶液: 用生理盐水配制, 浓度5mg/ml,2周内有效。以上溶液均经0.22 μm滤膜过滤除菌。考马斯亮蓝染液: 将考马斯亮蓝100 mg溶解于50 ml 95%乙醇中, 加100 ml 85%的磷酸,蒸溜水定容至1000 ml。 细胞裂解液: 为0.3 mol/L NaOH溶液, 用双蒸水配制。

PASMCs培养选用SD大鼠, 雌雄不拘, 体重180～200 g, 无菌取出其肺动脉段, 采用贴片法于37℃、 5%CO2条件下原代培养PASMCs,培养液为10%胎牛血清的DMEM。 静置培养4 d左右可见细胞从组织块边缘爬出, 待细胞生长至亚融合状态后即传代培养, 取3～6代生长良好的细胞进行实验。

MTT比色实验及总蛋白含量的考马斯亮蓝法测定按参考文献［1］进行, 分别将细胞接种于96孔培养板(每孔5×103细胞/100 l)和24孔培养板(每孔5×104细胞/ml), 培养24 h, 换无血清DMEM培养液继续培养24 h, 使细胞静止于G0/G1期, 换无血清DMEM培养液并根据实验分组加入不同试剂(ANP、 cNP和VNP分别在PMA之前1 h加入), 继续培养24 h, 以后检测步骤仍按参考文献［1］进行。

所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,方差分析进行显著性检验, 显著性水准为0.05。结果如下:

不同浓度PMA对PASMCs总蛋白含量和MTT之OD值的影响见图1A,B。 可见, 10－9～10－7 mol/L的PMA可使PASMCs总蛋白含量及MTT比色OD值均增加,与0 mol/L、 10－10 mol/L的PMA组之间均有显著差异(P＜0.05), 其中10－8 mol/L浓度时PMA刺激效应最强, 相应浓度的DMSO对PASMCs总蛋白含量及OD值无影响(P＞0.05),表明PMA可以刺激PASMCs的增殖并有剂量依赖性, 此效应与DMSO无关。

图1. PMA对PASMCs总蛋白含量和PASMCs MTT光吸收值的影响

fig.1.Effects of PMA on total protein and OD value of MTT in PASMCs.*P＜0.05,**P＜0.01 vs 0 and 10－10 concentration; n=10, mean±SD.

选取刺激效应最强的10－8 mol/L 浓度的PMA, 观察了ANP、 CNP、 VNP对PMA刺激PASMCs增殖的影响(图2A,B)。 VNP(10－8～10－6 mol/L)、 ANP和CNP (10－7～10－6 mol/L)均可显著降低(P＜0.05)PMA (10－8 mol/L) 刺激PASMCs总蛋白含量和MTT oD值, 作用强度VNP＞CNP＞ANP, 说明三种钠尿肽均可抑制PMA刺激的PASMCs增殖, 并有剂量依赖效应, 抑制效应以VNP为最强。

ANP、 CNP是维持体内水、 电解质平衡和血压稳定的重要肽类因子, 具有强大的利钠利尿和舒血管效应。随着研究的深入, 人们发现ANP、 CNP还可抑制多种细胞增殖。VNP是人工合成的钠尿肽家族的新成员,结构与CNP和ANP有很高的同源性。 研究表明［2, 3］, VNP与ANP、 CNP有类似的利钠利尿和舒血管效应,但对能否抑制细胞增殖目前尚无报道。我们以往的实验表明, VNP可以防止低氧大鼠肺动脉高压的形成, 抑制肺动脉高压大鼠肺动脉管壁增厚。 因此, 我们推测VNP可能有抑制PASMCs增殖的作用。本研究证明, aNP、 CNP和VNP均可抑制PMA刺激的PASMCs增殖, 从而证实了上述推测, ANP、 CNP的结果也与文献报道［4］基本一致。

图2.三种钠尿肽对PMA (10－8 mol/L) 刺激PASMCs总蛋白含量和PASMCs MTT光吸收值的影响

fig.2.Effects of three natriuretic peptides on total protein and OD value of mTT in PASMCs induced by PMA(10－8 mol/L).*P＜0.05, **P＜0.01 vs 0 concentration; n=10, mean±SD.

钠尿肽家族的受体目前已知有三种［5］: A受体、 B受体和C受体, 其中A受体、 B受体是鸟苷酸环化酶(GC)耦联受体, 故又称GC-A、 GC-B, c受体则不与GC耦联。ANP、 CNP与三种受体均可结合但亲和力不同, ANP与GC-A亲和力较高, CNP与GC-B亲和力较高。ANP、CNP与GC耦联受体结合后,激活GC, 使细胞内cGMP升高, 从而发挥生理效应, 与C受体结合主要介导自身清除或其它作用［6］, VNP与何种受体结合尚不清楚。本研究表明, VNP不但抑制PASMCs增殖,而且作用强于ANP和CNP, 由于A受体主要存在于内皮细胞, B受体主要存在于血管平滑肌细胞, 所以B受体可能是VNP的主要结合受体, 但VNP与ANP、 cNP的结构高度同源, 也有和A受体、 C受体或其它受体结合的可能。 和受体结合的情况有待进一步研究。

PASMCs异常增殖在肺动脉高压发病中具有重要意义, 是一重要的病理改变。肺动脉高压发生时, 体内多种血管活性物质和促细胞增殖因子水平升高,导致肺血管特别是肺小动脉紧张性增强和结构重建, 最终会引起水钠潴留、 水电解质紊乱, 其中PASMCs异常增殖又是其重要环节。 因此, 具有利钠利尿、舒张血管和抑制PASMCs增殖效应的钠尿肽，特别是VNP, 在肺动脉高压的防治中可能具有一定的应用价值。

supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39770317)

corresponding author. Tel: 029-3374574; E-mail: DMQ212@253.net董明清（第四军医大学生理学教研室)

朱妙章（第四军医大学生理学教研室)

于军（第四军医大学生理学教研室)

商立军（第四军医大学生理学教研室)

冯华松（唐都医院呼吸科, 西安 710032）

参考文献

［1］司徒镇强, 吴军正. 细胞培养. 西安: 世界图书出版西安公司, 1996, 186～189．

［2］Wei CM, Kim CH, Miller VM et al. A unique synthetic na～tri～uretic and vasorelaxing peptide. J Clin Invest, 1993, 92: 2048～2052.

［3］Feng HS (冯华松), Zang YM (臧益民), Zhu MZ (朱妙章) et al. Vasorelaxing effect of vasonatrin peptide on pulmonary artery in rats. Chin J Cardiac Func, 1998, 10(2): 69～71 (in Chinese with English abstract).

［4］Arjona AA, Hsu CA, Wrenn DS et al. Effects of natriuretic peptides on vascular smooth muscle cells derived from different vascular bed. Gen Pharmacol,1997, 28 (3): 387～392.

［5］Suga SI, Nakao K, Hosoda K et al. Re～ceptor selectivity of natriuretic peptide family, atrial natriuretic peptide, brain natriuretic peptide, and c-type natriuretic peptide. Endocrinology, 1992, 130 (1): 229～239．

［6］Levin ER. Natriuretic peptide C-receptor: more than a clear～ance receptor. am J Physiol, 1993, 264 (Endocrinol Metab 27): E483～E489.

received 1999-08-23Revised 1999-11-01