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河南师范大学生命科学学院；新乡453002徐存拴；夏民；卢爱灵；李效阳；李永辉；赵绪永；胡轶红
关键词：肝再生；构成性热休蛋白70/诱导性热休克蛋白68；蛋白水解酶；碱性磷酸酶；酸性磷酸酶；酶的原位复性电泳
摘要：本文以2/3肝切除(partial hepatectomy, PH)大鼠为模型, 探讨了PH后酸性和碱性磷酸酶(acid and alkaline phosphatases, ACP和AKP)、 构成性热休克蛋白70/诱导性热休克蛋白68(HSC70/HSP68)、 酸性和中性蛋白水解酶在肝再生期间(0～144 h)的动态变化。结果显示, 在肝切除后的肝再生期间: (1)ACP和AKP均出现两个活性高峰(4和48 h、 16和96 h), 在每个活性高峰之后, ACP 和AKP活性均有显著下降; (2)HSC70/HSP68在16和96 h时出现两个含量高峰,第二个高峰后的最低点(接近于对照)比第一个高峰后的最低点低许多; (3)在2/3肝切除后2～6 h时, 诱导出一个90 kD的中性蛋白水解酶; 36 h时, 诱导出一个27 kD的酸性蛋白水解酶。结果提示, ACP和90 kD中性蛋白水解酶可能参与激活G0期肝细胞进入G1期;AKP和HSC70/HSP68可能主要在DNA合成、 细胞代谢和增殖方面起作用; 27 kD酸性蛋白水解酶可能在肝细胞再分化和肝组织重建中有一定作用。
近些年,肝再生方面的研究较多地集中在与肝再生有关因子的分离与功能方面［1］。其实, 肝再生是一个涉及诸多因素非常复杂的过程,在肝再生过程中, 细胞除出现剧烈的形态和结构变化外, 生理、 生化、 代谢、 调控等方面也发生显著变化［1,2］。研究在这些变化中各种功能蛋白(酶)的作用及机理,有助于从分子水平揭示肝再生的本质［3］。
蛋白水解对生命是必不可少的［4］, 在肝再生中,原有组织的破坏、 受损和死亡细胞及细胞残体的消除、 细胞功能变化等都离不开蛋白降解。同时,以蛋白质降解为主的不可逆性调节机制是细胞调控生命活动的重要方式, 很多功能分子和调节成分的活化、 释放和消除也是通过蛋白降解方式。 有作者报道,肝再生的启动是由于肝细胞释放的蛋白水解酶(胶原酶和尿激酶)消化基质释放出肝细胞生长因子, 导致肝细胞去分化和增殖［1］。因此,研究蛋白水解酶在肝再生中的变化和作用对了解肝再生的分子过程有重要意义。
现已知,以磷酸化和去磷酸化为主的可逆性调节机制是细胞调控生命活动的重要方式［5］。其中,蛋白(酶)的磷酸化和去磷酸化是最重要和最广泛的调控方式。在蛋白(酶)的去磷酸化过程中,酸性磷酸酶(acid phosphatases,ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatases,AKP)起着十分重要的作用［6］。因此, 弄清楚在肝再生 (一个涉及非常广泛的细胞代谢和生理变化) 过程中磷酸酶的活性和作用,必将有助于阐明肝再生的分子机制和调节过程。
热休克蛋白是近几年发现的一类有重要生物学功能的分子［7］,它们与细胞抗逆性建立、 细胞内蛋白选择性降解［8］、 细胞分化和去分化、 细胞增殖［9］、 组织器官再生、 胚胎发育、 肿瘤发生、 许多疾病的发生等有密切关系［10］。在已知的众多热休克蛋白中,HSP70家族的热休克蛋白(包括大鼠的HSC70/HSP68)的作用最受人们关注［11］。 因此,研究HSC70/HSP68在肝再生中的作用, 无论是对进一步了解热休克蛋白的功能,还是对揭示肝再生的分子机制都有重要意义。
如果说肝大部分切除(PH)本身是启动肝再生的上游信号的话, 那么蛋白水解酶、 酸性磷酸酶、 碱性磷酸酶、 热休克蛋白等则可能是在信号指令下被激活的、 直接参与肝再生的功能分子。因此,研究这些分子在肝再生中的作用必将有助于了解肝再生的分子机制和调控过程, 本文在这些方面进行了初步探讨。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物成年SD纯系大鼠,由河南师范大学生命科学学院实验动物房提供, 雌雄各半, 体重200～250 g。
1.1.2化学药品及试剂明胶(Sigma)、 丙烯酰胺(USB)、 甲叉双丙烯酰胺(Fluka)、 过硫酸铵(Bio-Rad)、 四甲基乙二胺(Bio-Rad)、 SDS(Gibco)、 Tris-base(Gibco)、 硝酸纤维素膜(Gibco)、 标准分子量蛋白(上海东风生物技术有限公司)、 Tween 20(Fluka)、 考马斯亮蓝R250(Fluka 进口分装)、 HSC70/HSP68的一级抗体(StressGen, 产品编号SPA-820,为鼠源性单克隆抗体,其制备抗原是人HSC72/HSP70, 但亦能与人、 灵长目动物、 兔、 大鼠、 牛HSP70/HSC70的N端1～180氨基酸区域特异结合)、 二级抗体(华美生物工程公司产品, 为山羊抗鼠IgG-AP),过氧化物酶标记链霉卵白素(华美生物工程公司),本实验所用的化学试剂至少为分析纯。
1.2方法
1.2.1样品制备将大鼠随机分组(每组至少3只),乙醚麻醉, 按Higgins 方法切除2/3肝(即切除肝的左外叶和左中叶,以下简称PH),于室温分别恢复2、4、6、8、10、12、16、20、24、 36、48、72、96和144 h后, 脊椎脱臼处死, 摘除眼球放血, (1) 用于组织化学和免疫组织化学分析时, 直接切取肝脏备用; (2) 用于制备匀浆液时, 用肝门静脉灌注法将肝叶“洗白”后,取下置于加有冰冷生理盐水的培养皿中剪碎, 在4℃、40 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、 pH 7.5的缓冲液(材料湿重∶缓冲液=1∶5)中匀浆, 12000 g 离心10 min, 取上清液, 分装,-85℃保存备用。
1.2.2ACP和AKP的组织化学将肝脏切成5 mm×5 mm×3 mm小块, 置液氮中速冻后,用冰冻切片机连续切片(厚8 μm), 用4℃冷丙酮固定20 min, 以Gomori铅法显示ACP, 样品在保温液中保温(37℃)40 min;以Gomori钙-钴法显示AKP, 样品保温(37℃)1 h;用不加β－甘油磷酸钠的作用液做阴性对照。
1.2.3ACP和AKP活性的比色测定取0.1 ml匀浆液, 加入0.4 ml缓冲液(测定AKP 活性时, 用0.25 mol/L MgCl2、 0.2 mol/L Tris-HCl、 pH 7.5;测定ACP活性时, 用0.35 mol/L柠檬酸-NaOH-HCl, pH 5)和0.4 ml 0.01 mol/L β－甘油磷酸钠(空白对照加0.4 ml生理盐水), 混匀, 37℃保温30 min后, 再加入0.1 ml 50％三氯乙酸(空白对照在加入匀浆液时,同时加入0.1 ml 50％三氯乙酸), 混匀, 加2 ml三蒸水和3 ml定磷试剂(6N H2SO4∶H2O∶2.5％钼酸铵∶10％抗坏血酸＝1∶2∶1∶1)混匀后,于45℃恒温水溶锅内保温25 min, 取出待冷至室温后, 于660 nm处测定吸光值,从标准曲线上求出磷含量。
1.2.4HSC70/HSP68的免疫组织化学取同一肝叶的同一部位, 放入10％福尔马林中固定24 h,常规石蜡连续切片(厚6 μm), 间隔60 μm取一片, 每只动物取4 片做免疫组化染色, 其中, 在1∶500稀释的一抗中于4℃过夜,在1∶200稀释的二抗中于37℃保温1 h; 在1∶200稀释的SP中于37℃保温1 h, 用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法染色(染色过程中,用PBS代替一抗作阴性对照, 未热休克肝作正常对照), 用微波炉(92～98℃)对切片进行10 min抗原修复, DAB系统显色,苏木精复染［12］。
1.2.5蛋白质浓度测定、 聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶的原位复性电泳按Neuhoff等方法［13］测定匀浆液的蛋白质浓度; 检测总蛋白种类时,按Laemmli等方法［14］进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和显色; 检测肝脏的酸性、 中性和碱性蛋白水解酶活性时, 按徐存拴等方法［15］进行蛋白水解酶活性电泳(SDS-G-PAGE)和显色;检测AKP和ACP活性时, 按夏民等方法［16］进行ACP和AKP的原位复性电泳和显色。上述电泳的上样量均为每槽75 μg总蛋白。
1.2.6Western印迹Western印迹按Towbin等方法［17］进行。将SDS-PAGE凝胶板上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(电压500 V, 转移36 h), 将载有蛋白质的硝酸纤维素膜以 PBS/0.2％ Tween 20 封闭30 min, 弃去PBS/Tween 20,加入一抗(1∶500稀释), 37℃保温1 h, 每10分钟摇动一次, 然后用PBS洗去未结合一抗, 加入二抗(1∶1000稀释), 37℃保温1 h, 每10分钟摇动一次, 之后, 用PBS洗去未结合二抗,以DAB显色。
1.2.7体视学方法定量分析HSC70/HSP68按Weibel法［18］进行。每只动物取5张切片在10×10(物镜)、 10× 40(物镜)下分别计数阳性细胞的落点数Pxi和测试视野落点数Pri, 以公式Vv=∑Pxi/∑Pri,分别计算各组动物阳性细胞的体密度(其中, ∑Pxi和∑Pri分别为每组动物阳性肝细胞总落点数和测试视野总落点数),以方差分析作统计学处理。
2结果
2.1肝再生过程中ACP的分布及活性变化
2.1.1组织化学方法分析ACP主要存在于溶酶体中,细胞核中难以检出ACP 活性。虽然溶酶体在肝细胞质内均有分布, 但是, 核膜周围的细胞质中分布最多, 因此, 这个区域的ACP活性最强;显色情况和显微观察表明, 肝再生期间用组织化学方法测定的ACP活性变化情况和2.1.2基本一致; 在肝再生的各个恢复时间段,位于肝小叶中心区域细胞的ACP 活性较周缘区强, 而且从整体来看, 它在肝小叶内略呈分带现象(图1,见图版Ⅰ)。
