摘要：采用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉阻断前脑缺血模型, 以放射自显影（反向磷酸化, back-phosphorylation）及免疫印迹(Western blotting)法体外测定缺血时纹状体DARPP-32磷酸化水平和蛋白含量的变化。结果表明,短暂性缺血纹状体DARPP-32的免疫学活性和蛋白含量无明显改变。在缺血10 min内, 随缺血时间的延长, 体外DARPP-32的[32P]的掺入量在缺血5 min时升高, 在缺血2、7、10 min时均降低, 而反向磷酸化的测定结果表明体内DARPP-32磷酸化水平增高,说明缺血可诱导DARPP-32磷酸化水平变化。纹状体是中枢神经系统中对缺血比较敏感的部位[1]。大量文献表明, 缺血时纹状体神经细胞外兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)和多巴胺(dopamine, dA)含量明显升高, 而过量释放的EAA和DA是造成纹状体缺血性损伤的重要因素[2]。EAA主要是指谷氨酸(glutamate, Glu),它的兴奋毒作用引起细胞损伤, 而DA的作用机制仍不清楚。目前研究结果认为DA在纹状体的毒性作用主要是通过介导Glu的作用而产生的。而在纹状体DARPP-32(a dopamine and cyclic AMP-regulated phosphoprotein of Mr=32?000)[3]是Glu和DA发生直接作用的唯一结点。DA作用于D1受体使PKA活性增加, 从而磷酸化DARPP-32(Thr34),磷酸化的DARPP-32是蛋白磷酸酶1(PP-1)的强效抑制剂, PP-1的活性受到抑制, 使胞内一些蛋白质磷酸化程度增加[4],产生细胞损伤。本文通过放射自显影的方法研究了在缺血过程中DARPP-32的磷酸化状态, 从而阐明DA在纹状体缺血性损伤中的作_谩?期孙亚锋等:缺血引起沙土鼠纹状体DARPP-32磷酸化状态的变化生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷

１材料和方法

1.1试剂十二烷基磺酸钠(SDS), 三磷酸腺苷(ATP), PMSF, Kodak films均为Sigma产品; NC膜为Amersham产品; dARPP-32单克隆抗体为美国史坦福大学Hemmings博士惠赠; [γ-32P]ATP (185 PBq/mol)为北京亚辉公司产品。

1. 2动物模型蒙古沙土鼠(60~75 g), 雌雄不拘,由徐州医学院动物中心提供。缺血模型的制备按Toshiho[5]方法。腹腔注射水合氯醛(300~350 mg/kg)麻醉后, 分离双侧颈总动脉,以动脉夹阻断动脉血流。手术期间动物体温维持在36.5~37.5℃。

1. 3 DARPP-32酸抽提将缺血不同时间的沙土鼠立即断头、取出双侧纹状体, 迅速置入冷匀浆液中(mmol/L: Tris-HCl 10, EDTA 2, naF 2.5, PMSF 0.1; pH 7.4); 用电动组织匀浆器(Glas-Col)匀浆, 匀浆液加入5 ml冰冷的ZnAc (5 mmol/L)溶液中,4℃, 4?000 g离心15 min; 沉淀加入0.5 ml柠檬酸-磷酸缓冲液(pH2.8, 含0.1% Triton X-100, 2 μg/ml pepstatin A), 混匀后4℃, 28?000 g离心15 min; 上清液用NaH2PO4(0.5 mmol/L)调节pH至6.5, 4℃,16?000 g离心15 min后, 收集上清。

1.4 体外去磷酸化反应纹状体匀浆后, 将匀浆液一式两份, 一份直接进行DARPP-32酸抽提, 为对照组; 另一份37℃保温15 min,去磷酸化后再进行酸抽提, 为去磷酸化实验组。

1．5 DARPP-32的反向磷酸化测定按Barone[6]法。反应总体积为50 μl, 含(mmol/L): HEPES 50 (pH 7.4), MgCl210, EDTA 2, DTT 2, NaF 5, cAMP 10, 40 mg/ml, PKA催化亚基, 1 mmol/L [γ-32P]ATP (1 Bq/pmol),抽提的纹状体蛋白20 μg, 以ATP启动反应, 30℃反应60 min, 加入18 μl 蛋白处理液终止反应。以12.5%的分离胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离[7]。电泳完毕后凝胶经考马斯亮蓝R250染色、脱色、脱水、 真空干燥后, Kodak(Ls-7300) X-光胶片压片, －80℃ 放射自显影48 h。

1．6 免疫印迹(Western blotting)按Hemmings[8]方法, 酸抽提的组织蛋白(20 μg /Lane),经SDS-PAGE(12.5%)分离后, 以半干转移法转至NC膜上, 加入封闭液, 含3% BSA-TBS (mmol/L: Tris-HCl 150, pH7.6, NaCl 150, 0.05%叠氮钠), 45℃封闭8~12 h。然后加入1% BSA-TBS稀释的DARPP-32单抗1∶2?000),室温2 h。用50 ml TBST (0.05% Tween 20)洗膜, 2×20 min, 加入羊抗兔IgG-HRP (1∶50, 华美)二抗, 室温2 h后洗膜, 以免疫印迹化学发光法(ECL)检测蛋白区带。

2结果

2．1 体外去磷酸化对DARPP-32磷酸化水平的影响

将体外去磷酸化反应的样品及对照进行放射自显影。 去磷酸化反应后体外测定[32P]掺入量明显增加, 为对照组的150%。去磷酸化使DARPP-32磷酸化水平下降,而放射自显影测定结果是[32P]掺入量增加, 所以该方法的测定结果与DARPP-32的体内磷酸化状态刚好相反

2．2 不同缺血时间对DARPP-32磷酸化水平的影响

正常对照, 缺血2、5、7、10 min沙土鼠纹状体样品经放射自显影。缺血使纹状体DARPP-32体外[32P]掺入量下降。正常对照组和缺血2、7、10 min[32P]掺入量分别为100%、72%、87%、66%。而缺血5 min为124%。

2．3 DARPP-32免疫印迹结果

短暂性缺血的纹状体、海马样品经DARPP-32单克隆抗体Western blotting。纹状体DARPP-32蛋白含量在正常及缺血纹状体无明显改变, 但海马无明显区带显示。

3讨论

dARPP-32是受DA和cAMP调节的一种磷蛋白, 在纹状体中等大小棘状神经元中的含量非常丰富[9],其在细胞内的存在与DA能轴突末梢分布大致平行。这种蛋白质可作为PKA的底物, 在34位苏氨酸(Thr34)残基上磷酸化,磷酸化的DARPP-32可抑制蛋白磷酸酶1(PP-1)的活性。蛋白磷酸酶1在神经细胞内的含量很高, 活性很强, 可使许多功能蛋白、酶和结构蛋白脱磷酸,由于磷酸化DARPP-32对PP-1的抑制作用, 从而介导了DA通过D1受体活化和产生的病理、生理作用,故有人称其为DA的“第三信使”[10]。而缺血时大量释放的DA主要是增强了该途径的作用。磷酸化的DARPP-32可作为蛋白磷酸酶2B (PP-2B, CaN)的底物[3],而CaN是Ca2+依赖的蛋白磷酸酶。大量文献证实, Glu在缺血性脑损伤中的作用主要通过兴奋NMDA受体引起胞内Ca2+超载。DA-D1受体使DARPP-32磷酸化,抑制PP-1活性从而使NMDA受体的NR1亚基磷酸化[11], 增加Ca2+进入细胞。 磷酸化的DARPP-32还可使L型电压依赖性Ca2+通道持续开放,增加Ca2+电流, 而Ca2+浓度升高又可活化CaN和PP-1。缺血5 min时DARPP-32[32P]掺入量的增加, 可能是由于CaN的活化使DARPP-32的体内磷酸化降低。

反向磷酸化是研究DARPP-32磷酸化水平的一个通用手段。它实际上反映的是组织中脱磷酸化DARPP-32的含量, 体外测定时掺入的[32P]量增加,即表示体内DARPP-32磷酸化程度的降低(图1)。我们的实验结果证实, 脑缺血时, 纹状体DARPP-32体内的磷酸化水平增加, 缺血10 min, dARPP-32的磷酸化水平明显升高, 而体外掺入的[32P]仅为66%(图2)。我们认为,缺血时DARPP-32体内磷酸化的增高是由于DA的大量释放、活化D1受体, 导致信号转导通路增强所致;而在缺血很短时间内DARPP-32体内磷酸化的降低可能是由细胞内Ca2+增高活化CaN引起的。有文献报道[12], Ca2+浓度约在0.1~0.2 μmol/L时激活CaN,当浓度继续升高时, 主要激活蛋白激酶。因此, DARPP-32体内磷酸化水平, 可反映DA/D1-receptor/cAMP/PKA信号转导途径的功能状态,在脑缺血时, 可能与纹状体细胞的损伤程度相平行。

参考文献

[1]Ren YB, Li XD, Xu ZC. Asymmetrical protection of neostriatal neurons against transient forebrain ischemia by unilateral dopamine depletion. Exp Neurology,1997, 146:250~257.

[2]Hirotaka I, Mayumi O, Shigenobu S et al. Effect of transient forebrain ischemia on long-term enhancement of dopamine release in rat striatal slices. brain Res, 1995, 671:95~99.

[3]Fienberg AA, Hiroi PG, Mermelstein WJ et al. DARPP-32: regulator of the efficacy of dopaminergic neurotransmission. Science, 1998, 281:838~842.

[4]Wozniak E, Oldziej S, Ciarkowski J. Molecular modeling of the catalytic domain of serine/threonine phosphatase-1 with the Zn2+ and Mn2+ nuclear ion centers in the active site. Comput Chem, 2000, 24:381~390.

[5]Toshiho O, Matsumoto M, Kitagawa K. Delayed neuronal death in ischemic hippocampus involves stimulation of protein tyrosine phosphorylation. Am J physio,1996, 271:1085~1097.

[6]Barone P, Morellim M, Dopoli M et al. Behavioural sensitization in6-hydroxydopamined lesioned rats involves the dopamine signal transduction: changes in DARPP-32 phosphorylation. Neuroscience, 1994, 61:867~873.

[7]Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227:680~685.

[8]Hemmings HC, Greengard P. DARPP-32, a dopamine and adenosine 3′: 5′-monophosphate-regulated phosphoprotein: regional, tissue, and phylogenetic distribution. J Neurosci,1986, 6(5):1469~1481.

[9]Kurihara T, Lewis RM, Eisler J et al. Cloning of cDNA for DARPP-32, a dopamine- and cyclic AMP-regulated neuronal phosphoprotein. J Neurosci, 1998,8:508~517.

[１0]Greengard P. Neuronal phosphoproteins. Mediators of signal transd