摘要：用细胞培养、内皮素放射免疫测定和RT-PCR的方法, 探讨醛固酮对心室成纤维细胞分泌内皮素的影响。结果显示, 醛固酮(1×10－７ mol/L)能促进心室成纤维细胞ppET-1 mRNA的表达, 在作用后2 h, 表达开始增加, 4 h达高峰, 以后逐渐下降;同时醛固酮能增加成纤维细胞内和条件培养液中内皮素的含量。其受体阻断剂螺旋内酯(1×10－６ mol/L)能拮抗醛固酮的作用,提示醛固酮能促使心室成纤维细胞分泌内皮素, 且此作用是通过其受体介导的。肾素-血管紧张素-醛固酮系统与心脏肥厚的发生、发展有密切的关系。它参与心肌细胞的肥大、心室成纤维细胞增殖以及细胞外基质的产生,其作用与血流动力学因素的关系不大, 而与激素本身的作用有关[1]。近年来有大量的文献报道, 血管紧张素Ⅱ能促进心室成纤维细胞分泌生长因子,这与心肌肥大的形成有关[2~4]。我们的实验已证实, 心室成纤维细胞能分泌内皮素,这对心脏重塑起重要作用。本实验拟观察醛固酮对心室成纤维细胞分泌内皮素的调控作用, 从而进一步阐明醛固酮在心脏局部的作用。

１材料和方法

1.1心室成纤维细胞培养取1~3 d龄的SD大鼠(雌雄不限, 中山医科大学实验动物中心提供),在无菌条件下开胸剪取心室肌。用胰蛋白酶消化获取心肌细胞和成纤维细胞。采用差速贴壁1 h, 获得成纤维细胞。实验采用已传1~2代的成纤维细胞。

1.2心室成纤维细胞内皮素(endothelin, ET)含量的测定将已传1~2代的心室成纤维细胞(3~5×105/ml)接种于25 ml的玻璃培养瓶中,待细胞生长至亚融合状态时, 将生长培养液(10%血清) 换为低1期龚素珍等: 醛固酮对心室成纤维细胞分泌内皮素的影响生理学报 Acta Physiol. sin. 53卷血清培养液(1%血清)培养24 h, 再换为加入各种处理因素的无血清培养液继续培养3 d。实验分组为正常对照组(不加处理因素)、醛固酮组、醛固酮(1×10－７ mol/L)+螺旋内酯组(预处理2 h, 1×10－６ mol/L)和螺旋内酯组(1×10－６ mol/L)。吸出各瓶的培养液, 细胞用D-Hanks液(4℃)迅速冲洗2次, 充分吸干瓶内的残存液后, 再加入200μl/瓶的蛋白提取液(4℃), 其组成成分为(mmol/L): β-磷酸甘油 20, benzamidine 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl50, EDTA 5, EGTA 5, Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH 7.4), Triton-100 0.1%(v/v), PMSF0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, β-巯基乙醇 0.3%(v/v)。细胞于冰上孵育数分钟后, 迅速刮下并用超声破碎细胞5 s, 离心(13?000×g, 10 min)去除沉淀, 上清留作ET测定。药盒购自北京东亚免疫技术研究所, 操作按说明书进行。

1.3成纤维细胞培养液中ET含量的测定将吸出的各瓶培养液(4 ml)置于Eppendorf管中离心(13?000×g, 10 min), 去除沉淀,测上清ET含量。

1.4心室成纤维细胞ppET-1 mRNA的表达收获4×105细胞/ml, 用TRIzol试剂盒(美国life Technologies公司)提取细胞总RNA。总RNA提取后, 用紫外分光光度计测定其浓度和纯度, 计算样品总RNA浓度。ppET-1 mRNA寡聚核苷酸引物是根据Lariciere等[5]的序列:上游5′-CTA GGT CTA AGC GAT CCT TG-3′, 下游5′-TTC TGG TCT CTG TAG AGT tC-3′(上海生物工程公司), 用这对引物可扩增出长度为319 bp的ppET-1 cDNA片段; GAPDH mRNA寡聚核苷酸引物是根据Fort等[6]发表的大鼠组织的序列设计合成的: 上游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′,下游5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′, 这对引物可扩增出长度为443 bp的GAPDH cDNA片段。取样品总RNA ２ μg,分别用0.4 μmol/L特异性的ppET-1 mRNA引物和GAPDH mRNA引物, 采用TitanTM一步法RT-PCR试剂盒(BOEHRINGER mANNHEIM 公司)进行逆转录聚合酶链式反应, 总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物８ μl, 加２μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,80 V, 45 min, 用GDS凝胶成像系统拍摄打印结果, 条带用计算机图像分析系统扫描定量。所有实验均重复3次。

1.5统计学处理实验均重复3次, 数据均以mean±SD表示, 组间数据处理根据处理方差齐性分析结果, 采用非配对t检验。

2结果

2.1醛固酮对心室成纤维细胞中ET含量的影响

用蛋白抽提液提取已培养3 d, 并加入各种处理因素的心室成纤维细胞的总蛋白, 用于测定其中的ET含量。与无血清DMEM培养液相比, 醛固酮(1×10－７ mol/L)能明显增加心室成纤维细胞中的ET含量, 醛固酮特异性受体阻断剂螺旋内酯(预处理2 h, 1×10－６ mol/L)能阻断醛固酮的这种作用,但其自身对心室成纤维细胞的ET含量没有影响。

2.2醛固酮对心室成纤维细胞培养液中ET含量的影响

收集已培养3 d, 并加入各种处理因素的心室成纤维细胞培养液(4 ml), 用于测定其中的ET含量。与无血清DMEM培养液相比, 醛固酮(1×10－７ mol/L)能明显增加心室成纤维细胞培养液中的ET含量, 醛固酮特异性受体阻断剂螺旋内酯(预处理2 h, 1×10－６ mol/L)能阻断醛固酮的这种作用,但其自身对心室成纤维细胞培养液中的ET含量无显著影响。

2.3醛固酮对心室成纤维细胞ppET-1 mRNA表达的影响

在无血清培养的心室成纤维细胞培养液中加入1×10－７ mol/L的醛固酮后1、 2、 4、 6和12 h, 分别测定ppET-1 基因表达水平。在2 h时, ppET-1基因表达开始增加, 4 h达高峰(P＜0.01), 以后逐渐下降, 12 h接近对照水平。

用1×10－７ mol/L 醛固酮作用心室成纤维细胞 4 h, ppET-1 基因表达明显增加(P＜0. 01), 预先加入 (1×10－６ mol/L)螺旋内酯作用于心室成纤维细胞2 h, 再加入 1×10－７ mol/L 醛固酮作用4 h后, ppET-1基因表达与对照组相比无明显差异,而螺旋内酯本身并不诱导 ppET-1 基因表达。提示醛固酮诱导心室成纤维细胞 ppET-1基因表达是通过特异性受体介导的。

3讨论

本实验结果显示, 醛固酮能明显增加心室成纤维细胞内和其培养液中的ET含量; 醛固酮也能诱导ppET-1基因表达, 2 h表达开始增加, 4 h达高峰, 而醛固酮特异性受体阻断剂螺旋内酯则能明显阻断醛固酮的上述两种作用。

我们已经证实, 新生大鼠心室成纤维细胞在无外界因素作用下能分泌ET等生物活性物质, 促进心肌细胞肥大[7],增加搏动频率[8]以及促进成纤维细胞胶原的合成和增殖。本实验也发现心室成纤维细胞培养液中含有大量的ET, 其量明显多于细胞内的含量,表明细胞自身并不储备过多的ET。醛固酮促进心室成纤维细胞分泌ET的作用可被醛固酮特异性受体阻断剂螺旋内酯所阻断,表明醛固酮的这种作用是通过特异性受体(盐皮质激素受体)介导的。

内皮素是1988年由Yanagisawa等人在培养的猪主动脉内皮细胞中分离并提纯的多肽, 分为ET-1、 ET-2、 ET-3及血管收缩肽四种异构肽,在心脏局部及全身循环中起重要作用。醛固酮主要在肾上腺皮质球状带中合成, 进入血液循环发挥其保钠排钾的生理作用。但近年来人们发现, 心脏局部能合成醛固酮[9],心脏中的许多细胞存在醛固酮的特异性受体[10], 在心脏的醛固酮参与心脏纤维化[11], 增加心肌细胞中Na+/K+ aPT酶的主要亚单位的表达[12]以及降低心肌细胞中的蛋白激酶C的活性[13]。人们发现, 无论是在分子水平还是在整体激素或血流动力学调节等方面,均存在ET-1和肾素-血管紧张素-醛固酮系统交互作用的位点。ET-1能刺激肾上腺皮质球状带中的醛固酮分泌[14],促进肾上腺皮质生长。ET-1的这种作用在发生充血性心力衰竭、恶性高血压以及内毒血症等疾病时, 由于内皮损伤、高血压和醛固酮过多症合并存在,表现尤为突出。而肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的血管紧张素Ⅱ通过其Ⅰ型受体,能影响血管平滑肌和内皮细胞的ET-1合成[15,16]。另外ET-1和肾素-血管紧张素-醛固酮两个系统对血压维持和对高血压的并发症也存在协同/或拮抗作用。我们的实验显示醛固酮能促使心室成纤维细胞分泌ET,表明在心脏局部, 肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的醛固酮能影响ET的合成。

参考文献

[1]Sun Y, Ratajska A, Zhou G et al. Angiotensin converting enzyme and myocardial fibrosis in the rat receiving angiotensin Ⅱ or aldosterone. J Lab Clin Med,1993, 122: 395~403.

[２]Kim NN, Villarreal FJ, Printz MP.Trophic effects of angiotensin Ⅱ on neonatal rat cardiac myocytes are mediated by cardiac fibroblasts.AmJPhysiol,1995, 269 (Endocrinol Metab 32): E426~E43.

[３]Sil P, Sen S. Angiotensin Ⅱ and myocyte growth-role of fibroblasts.Hypertension, 1997, 30 (Pt 1): 209~216.

[４]Gray MO, Long CS, Kalinyak JE et al. Angiotensin Ⅱ stimulates cardiac myocyte hypertension via paracrine release of TGF-β1 and endothelin-1 from fibroblasts. cardiovasc Res, 1998, 40: 352~363.

[５]Lariviere R, Day R, Schiffrin EL. Increased expression of endothelin-1 gene in blood vessels of deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. hypertensin, 1993, 21 (6 Pt 2): 916~920.

[６]Fort P, Marty L, Piechaczyk M et al.Various rat adult tissues express only one major mRNA species from the glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase multigenic family. Nucleic Acids Res, 1985, 13 (5): 1431~1442.

[７]Gong SZ