摘要：运用逆转录-多聚酶联反应(RT-PCR)、鞘内注射和反义技术, 研究脊髓水平一氧化氮 (NO) 对大鼠吗啡戒断反应和脊髓及脑干NMDA1A 受体mRNA(NMDA1AR mRNA)表达的影响。结果表明, 鞘内注射NOS反义寡核苷酸能明显减轻吗啡戒断反应, 且脑型NOS (nNOS)反义寡核苷酸的作用强于内皮型NOS(eNOS)反义寡核苷酸。吗啡依赖大鼠脊髓和脑干NMDA1AR mRNA表达增加, 纳洛酮催促戒断, 使其进一步增加; 鞘内注射nNOS反义寡核苷酸,能明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓和脑干NMDA1AR mRNA表达的增加; eNOS反义寡核苷酸也可抑制吗啡戒断大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达的增加,但作用弱于nNOS反义寡核苷酸, 对脑干NMDA1AR mRNA表达无明显影响。上述结果提示: 脊髓水平NO参与介导吗啡戒断反应和NMDA受体表达的调控。谷氨酸/NMDA受体是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质/受体系统, 它参与了机体多种生理和病理过程,如学习记忆、神经元可塑性改变等。自Trujillo等[1]首次报道NMDA受体拮抗剂MK-801可抑制吗啡镇痛耐受和纳洛酮催促戒断症状以来, NMDA受体在吗啡耐受、依赖和戒断中的作用便得到广泛而深入的研究。现已证实,在全身或中枢神经系统内, 应用NMDA受体拮抗剂均可抑制吗啡耐受、依赖和戒断的形成和发展, 提示NMDA受体的激活在吗啡耐受、依赖和戒断的形成和发展中发挥重要作用。 koyuncuoglu 等[2]研究表明, 长期应用吗啡和纳洛酮戒断可上调NMDA受体水平; zhu等[3]报道脑室内注射NMDA1受体的反义寡核苷酸能明显减轻吗啡戒断症状, 提示NMDA受体水平对吗啡耐受、依赖和戒断过程有重要影响。NMDA受体水平变化可能在长期使用吗啡导致神经元可塑性改变中发挥重要作用,但人们对吗啡依赖和戒断过程中NMDA受体表达的调控或胞内信号转导系统对NMDA受体表达的影响还不十分清楚。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有高反应性的自由基, 参与了机体多种生理和病理过程。大量研究表明, nO也参与了吗啡耐受和依赖的形成和发展。行为学结果显示, 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制剂能有效阻止吗啡镇痛耐受和躯体依赖的发展[4,5];而NO供体可加速吗啡耐受的进程[6]。NMDA受体和NO/cGMP通路存在着密切的联系。NMDA受体兴奋可通过增加胞内Ca2+浓度, 激活NOS, 生成NO; nO又可作为逆行信使弥散至突触前, 通过激活cGMP通路增加谷氨酸释放, 从而进一步易化NMDA受体。那么, 吗啡戒断过程中NO是否参与了NMDA受体表达调控呢？目前尚无报道。本实验利用逆转录-多聚酶联反应(RT-PCR)和反义技术,研究了吗啡戒断过程中NO对脊髓和脑干NMDA1AR mRNA表达的影响。

１材料和方法

1.1材料和试剂雄性SD大鼠(200~250 g)由上海动物中心提供。吗啡系沈阳制药厂产品, 纳洛酮由北京四环制药厂生产;总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒为美国Promega公司产品; PCR试剂盒、琼脂糖、PCR marker购自上海华美公司。NOS反义寡核苷酸由上海生物工程公司合成; LipofectinAMINE购自GibcoBRL公司。其他试剂至少为分析纯。

1.2鞘内埋管大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后, 固定于鼠板。 在枕骨大孔上方纵向切开约1.5~2.0 cm切口, 钝性分离皮下组织和颈部肌肉,暴露枕骨大孔。 用针尖挑破寰枕膜, 可见澄清脑脊液流出且液面随呼吸节律上下波动。将已经消毒的, 一端缠有米粒大小parafilm小结,一端火烧封口充满生理盐水的PE-10导管, 小心缓慢地插入鞘内至脊髓胸腰段(插入深度5.5~6.0 cm)。导管插入后, 将小结直接缝在肌肉上或缝埋在肌肉下,逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤。待动物清醒后, 观察其活动情况, 剔除肢体瘫痪的动物不用, 用利多卡因实验确定导管在鞘内。术后常规使用抗菌素, 分笼单独饲养5~7 d后即可用于实验。

1.3动物模型与分组鞘内埋管成功大鼠皮下注射吗啡或生理盐水。吗啡首日10 mg/kg, 每日2次, 隔日每次增加10 mg/kg, 至第6天末次注射50 mg/kg, 建立吗啡依赖模型, 此组为吗啡依赖组, 注射等容生理盐水者为正常对照组; 吗啡依赖大鼠在末次注射吗啡后4 h腹腔注射纳洛酮4 mg/kg,建立吗啡戒断模型。在纳洛酮激发戒断前24和12 h, 分别鞘内注射0.3 nmol脑型NOS (nNOS)反义寡核苷酸、内皮型NOS (eNOS)反义寡核苷酸、nNOS有义寡核苷酸(均溶于20μl 20%的LipofectinAMINE)和等容的20% LipofectinAMINE。 此四组分别为脑型反义组、内皮反义组、脑型有义组和戒断对照组。

1.4戒断症状评分在纳洛酮激发戒断后的1 h内, 根据湿狗样抖动、异常姿势、激惹症状、咬牙、植物神经系统症状、体重降低等进行戒断症状评分。

1.5NOS反义寡核苷酸和NMDA1A受体引物设计脑型NOS特异性的反义寡核苷酸根据基因结构,针对翻译起始密码ATG的-11到+7的碱基设计反义寡核苷酸的序列为5′-CTT CCA TGG TAT CTG TGT-3′, 有义寡核苷酸的序列为5′-ACA cAG ATA CCA TGG AAG-3′。内皮型NOS的反义寡核苷酸的序列为

5′-TCC CCA TGA GTG AGG CAG-3′。NMDA1A受体两条引物序列分别为: 上游引物为(244-261)5′-CAT GCA CCT gCT GAC ATT 3′, 下游引物为(701-718)5′-CGA GTC TAC AAC TGG AAC 3′, 扩增长度为475 bp的cDNA片段。经检验, 引物与基因库之间无特异性同源区域。平行参照的β-actin两条引物序列分别为: 上游引物为5′-TCA TGA AGT GTG aCG TTG ACA TCC GTA AAG3′, 下游引物为5′-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG ACG3′,扩增长度为409 bp。

1.6RT-PCR所有动物在纳洛酮注射1 h后断头处死, 迅速分离并取出脊髓胸腰段(约2 cm)和脑干(小脑正中下)各50 mg, 按试剂盒说明进行样品处理、 rNA抽提、 RNA沉淀与重悬浮、 RNA漂洗, 最后得到RNA沉淀。用紫外分光光度计测定总RNA浓度, A260 nm/A280 nm为1.8~2.0。提取的总RNA置于－70℃保存。取2 μg总RNA于65℃变性3 min后, 依次加入10×buffer、10 mmol/L dNTP混合物、 oligo(dT)、RNA酶抑制剂和AMV逆转录酶, 总反应体积为20 μl。42℃反应90 min, 95℃ 5 min后终止反应,加水稀释至100 μl。取逆转录反应液20 μl, 分别进行NMDA1A和β-actin基因的PCR扩增。PCR反应液总体积为50 μl, 包括Tris-HCl10 mmol/L, pH 8.3, KCl 50 mmol/L, 0.1% Triton X-100, MgCl2 1.5 mmol/L, dNTPS 0.2 mmol/L, DTT 5 mmol/L, 上下游引物各50 pmol 于94℃变性10 min, 加TaqDNA聚合酶2.5 U, 再覆盖石蜡油50 μl,94℃变性2 min后进行PCR循环, 条件为: 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 完成35个循环后, 72℃再延伸10 min后置于冰浴中。取15 μl NMDA1A受体和5 μl β-actin的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳, 5 V/cm, 60 min,用自动成像仪(FOTODYNE, USA)观察拍照, 重复实验的电泳图谱用STORM860荧光扫描分析仪分析,相对表达量根据各电泳区带的面积和平行对照β-actin的面积之比来计算。

1. 7统计采用单因素方差分析比较各组间差异的显著性。数据用均数±标准差表示。

2结果

2.1鞘内注射NOS抑制剂和NOS反义寡核苷酸对大鼠吗啡戒断症状评分的影响

鞘内注射nNOS反义寡核苷酸明显降低吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断症状评分, eNOS反义寡核苷酸也可降低戒断症状评分, 但其作用弱于nNOS反义寡核苷酸, nNOS有义寡核苷酸对吗啡戒断症状评分无明显影响。

2.2鞘内注射NOS反义寡核苷酸对吗啡戒断大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达的影响

扩增产物电泳后经扫描分析, 与正常大鼠相比, 吗啡依赖大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达明显增加, 纳洛酮催促戒断大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达较吗啡依赖大鼠又进一步增加。 鞘内注射nNOS反义寡核苷酸能显著降低吗啡戒断大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达, 而其有义寡核苷酸作用不明显,鞘内注射eNOS反义寡核苷酸也能抑制吗啡戒断大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达, 但其作用弱于nNOS反义寡核苷酸。

2.3鞘内注射NOS反义寡核苷酸对吗啡戒断大鼠脑干NMDA1AR mRNA表达的影响

与脊髓一样, 吗啡耐受和戒断大鼠脑干的NMDA1AR mRNA表达明显增加。鞘内注射nNOS反义寡核苷酸能显著降低吗啡戒断大鼠脑干NMDA1AR mRNA表达,而其有义寡核苷酸和eNOS反义寡核苷酸作用不明显。

3讨论

反义技术是一项特异、高效和具有广泛意义的调控特异基因表达的策略, 被广泛应用于各种病毒癌基因和细胞生长因子的抑制和调节,已成为研究基因表达变化和功能关系的重要手段。反义寡核苷酸功能的表达很大程度上由其稳定性和细胞对它的摄取量来决定。将反义寡核苷酸予以化学修饰并选择合适的转运载体,是提高反义寡核苷酸稳定性和增加细胞摄取量的有效方法。本实验采用磷酸修饰的反义寡核苷酸,以多价阳离子脂质体lipofectinAMINE为转运载体以及用鞘内注射的方法, 得到了满意的效果。

本实验中, 鞘内注射nNOS反义寡核苷酸抑制nNOS基因的表达能明显抑制吗啡戒断症状, 而nNOS有义寡核苷酸无效,证实nNOS基因产物参与了吗啡依赖和戒断过程。nNOS可使脊髓水平NO大量产生, 参与吗啡戒断反应。Machelska等[7]利用原位杂交和免疫组织化学的方法, 也证实慢性吗啡处理大鼠脊髓NOS mRNA表达水平增加。Cuellar等[8]的研究显示,吗啡依赖和戒断大鼠多个脑区的nNOS免疫活性明显增强。鞘内注射eNOS反义寡核苷酸效果不明显,提示吗啡戒断过程中NO的大量产生主要是nNOS作用的结果。Moore等[9]采用了7-nitroindazole (7-NI), 这是一种选择性nNOS抑制剂,比其他NOS抑制剂更能有效地抑制吗啡耐受和戒断, 也证实了这一观点。

nMDA受体(NMDAR)是由NMDAR1和 NMDAR2两