摘要：应用条件-检验刺激技术观察时间依赖性抑制现象是研究传入信息相互作用的方式之一。 用1.5～3倍阈刺激强度的电脉冲交替刺激麻醉、麻痹大鼠的盆神经(Pe)和阴部神经(Pu),以玻璃微电极在L6-S1节段脊髓背角会聚神经元上记录细胞外放电。条件输入可对深层(＞300 μm)单位的检验反应产生时间依赖性抑制效应, 产生抑制的刺激间期为1～360 ms, Pe为条件刺激时较长。 浅层细胞(＜300μm)发生抑制的间期为1～3 ms, 无明显时间依赖性抑制。 C5-6水平冷冻阻滞神经传导可部分减弱深层单位的时间依赖性抑制, Pe为条件刺激时减弱更明显。结果提示, 深层腰骶髓背角神经元中Pe传入对Pu传入的抑制更强, 脊髓上中枢对这种抑制有促进作用。躯体内脏传入在不同水平的会聚常用来解释牵涉痛和针灸的机理。 迄今为止, 国内外学者对躯体内脏传入的研究多集中于单向作用,而对两者之间相互作用的研究尚未见报道。躯体与内脏的自然刺激引起的神经活动在相应节段的脊髓神经元上发生会聚反应［1］, 内脏传入在脊髓存在大量扩散［2］,研究异源性传入纤维的相互作用对解释有关生理现象有重要意义。 阴部神经(pudendal nerve, Pu)传入纤维属躯体传入, 盆神经(pelvic nerve Pe)传入纤维属内脏传入, 两者分布的节段在腰6-骶1(L6-S1)重叠, Pe和Pu在脊髓背角的会聚已被电生理学［3］所证实。

研究同一来源传入信息整合过程时,常观察神经元对间隔一定时间的两个刺激的兴奋性反应, 通常第一个刺激引起的反应明显强于第二个刺激反应; 刺激间隔时间延长时,对第二个刺激的抑制反应消失, 称为时间依赖性抑制［4］。 我们用同样方法, 在证实Pu和Pe在同一个单位上会聚的基础上,观察两种传入信息相互作用的时间依赖性抑制现象。

1材料和方法

1.1手术Wistar大鼠, 雌雄不拘, 雌性体重200～250 g, 雄性体重200～300 g。 2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,待呼吸平稳、有齿镊夹捏皮肤无反应后, 施行气管插管、颈静脉插管术; 行椎板切除术暴露L5-S2节段脊髓; 分离骶髂关节暴露Pe及Pu,分别置于保护性刺激电极上, 两电极之间以厚聚乙烯薄膜隔离,以防电流扩散, 神经周围以石蜡油棉球绝缘。 术后大鼠用氯化筒箭毒(0.1%, 0.2ml)麻痹,接人工呼吸机。 静息1h后将大鼠脊髓暴露部位的前后椎板以脊髓固定夹固定,使动物呈悬吊状态。 用游丝镊撕开硬脊膜, 在脊髓暴露部位周围用琼脂糖筑槽,灌温热石蜡油。 实验中每隔1 h腹腔注射1%戊巴比妥钠2 ml、0.1%氯化筒箭毒0.2 ml维持麻醉和麻痹, 注意保持大鼠呼气末CO2浓度为3%～4%,肛温为37±1℃。 冷冻阻滞组在C5-6节段行椎板切除术备用。

1.2刺激与记录经恒流隔离器(S5-201J, 日本光电工业株式会社)给予Pe和Pu 1.5～3倍阈值的方波单脉冲刺激(200 μm, 1 Hz)［8］,两神经的刺激强度均保持阈值的同样倍数。 应用条件-检验刺激技术, 随机选择一条神经给予条件刺激, 另一条施检验刺激, 两刺激间隔1～400 ms。逐渐缩短刺激间期, 记录检验反应被半数抑制或抑制刚发生时的刺激间期。交换刺激方式, 重复上述记录。

用玻璃微电极(5～30 MΩ)在L6-S1节段背角记录细胞外诱发放电, 信号经探头输入微电极放大器(MEZ-8201,日本光电工业株式会社),输出信号显示于示波器(VC-11, 日本光电工业株式会社), 随时监视和采集信号, 并以X-Y函数记录仪(辽宁精密仪器厂)记录。

冷冻阻滞组的大鼠用上述方法记录作为对照后, 把小冰块放于 C5-6节段手术切口周围肌肉组织自然形成的槽内, 利用冰水混合物阻滞神经传导。20～30 min后重复上述记录后去除冰块, 用温热生理盐水冲洗30 min直至恢复神经传导。

1.3结果分析实验结果以 ±s表示。 出现时间依赖性抑制时, Pe为条件刺激时发生抑制的刺激间期作为100%, Pu为条件刺激的值用与Pe值相比较的百分数表示(%)。冰冻组阻滞前的值为100%, 阻滞后与阻滞前相比较的百分数(%)作为阻滞后的值。 不同条件刺激及阻滞前后的数据分别用配对t检验分析, 显著性水准为0.05。

2结果

2.1记录单位的一般描述

在大鼠脊髓L6-S1节段共记到84个单位的诱发反应, 未见自发放电活动。反应锋电位数1～11个, 记录深度为脊髓表面下3～1543 μm,反应潜伏期1～70 ms。 根据潜伏期和传导距离计算传导速度为1.6～50 m/s, 提示所激动的纤维包括A与C类。

84个单位中, 仅对Pe或Pu发生反应, 对Pe及Pu均发生反应的数目分别为39 (Pe, 46%、深度123～1543 μm)、16 (Pu, 19%,深度69～1068 μm)和29(Pe+Pu, 35%)。 其中系统地观察了21个Pe+Pu会聚单位, 据其深度及反应形式分为浅于 300 μm(6个)与深于300 μm (15个)两类单位。

2.2浅于300 μm会聚单位的反应

共6例, 记录深度3～244 μm, 其中5例为短潜伏期(0.5～1.5 ms); 出现单个反应锋电位; 检验反应被抑制时的刺激间期为1～3 ms(图1),以Pu为条件刺激时发生抑制的平均间期为3.53±2.32 ms, 以Pe为条件刺激时发生抑制的平均间期为3.82±2.77 ms, 未见显著差异。浅层单位中有1例发生时间依赖性抑制现象, Pu作为条件刺激抑制Pe反应的时间间期是13 ms, Pe作为条件刺激抑制Pu反应的时间间期是15 ms。

2.3深于300 μm会聚单位的反应。

单位的反应潜伏期为1～70 ms, 反应锋电位数1～11个, 发生抑制的时间间期1～360 ms,有明显的时间依赖性抑制现象。10例深度在300～1000μm的会聚单位中, Pe为条件刺激时,发生时间依赖性抑制的刺激间期均长于Pu为条件刺激时(图2)。以Pe为条件刺激的平均抑制时间间期为(100±0)%,以Pu为条件刺激的时间间期为(48.91±11.57)%,有非常显著的差异(P＜0.01)(图3)。5例记录深度在1041～1320μm的单位中, Pu为条件刺激时,发生抑制的平均刺激间期(137.2±43.3)%长于Pe为条件刺激时(100±0)%,无统计学差异。

2.3深于300 μm会聚单位的反应

单位的反应潜伏期为1～70 ms, 反应锋电位数1～11个, 发生抑制的时间间期1～360 ms,有明显的时间依赖性抑制现象。10例深度在300～1000μm的会聚单位中, Pe为条件刺激时,发生时间依赖性抑制的刺激间期均长于Pu为条件刺激时(图2)。以Pe为条件刺激的平均抑制时间间期为(100±0)%,以Pu为条件刺激的时间间期为(48.91±11.57)%,有非常显著的差异(P＜0.01)(图3)。5例记录深度在1041～1320μm的单位中, Pu为条件刺激时,发生抑制的平均刺激间期(137.2±43.3)%长于Pe为条件刺激时(100±0)%,无统计学差异。

2.4C5-6冰冻阻滞对时间依赖性抑制的影响

4例深度在300～1000 μm存在时间依赖性现象的会聚单位于C5-6节段实行冰冻阻滞15～20 min后, 4例单位产生的时间依赖性抑制的刺激间期均缩短, pe为条件刺激时由(100±0)%缩短至(65.75±10.13)%, 阻滞前后的反应差异显著(P＜0.05), Pu为条件刺激时由100±0%缩短至(86.32±7.92)%,阻滞前后无显著差异。

在深于1000 μm存在时间依赖性抑制的会聚单位中, 有4例只在Pe为条件刺激时发生时间依赖性抑制, 而Pu为条件刺激时末出现。其中两例于C5-6给予冰冻阻滞后, pe为条件刺激时发生抑制的刺激间期缩短, 而Pu为条件刺激的刺激间期未见改变。

3讨论

本实验观察到, 脊髓背角中对Pe和Pu刺激分别发生反应的单位占46%和19%, 对二者均出现反应的会聚单位占35%, 表明Pe和Pu传入输入在腰骶髓会聚,且Pe传入在中枢有弥散分布的倾向。 骶髓副交感核的中间带处存在着中间神经元［5］, 盆神经传入可能和这些中间神经元形成突触联系。中枢扩散化使内脏感觉定位趋于不明确。 本实验中, 深层会聚单位存在的时间依赖性抑制现象, 以Pe传入对Pu反应的抑制为主。 腰骶髓后联合核(DCN)和中间带(IM)形成的‘内脏面’参与以Barrington核为中枢的排尿反射回路［5］,来自膀胱内的压力信息由Pe上传, Pe感觉信息优先传导与排尿反射的发起有关。 本实验浅层会聚单位中反应潜伏期短, 不存在时间依赖性现象的结果,提示浅层神经元的主要功能似乎不是进行复杂的信息整合, 而是促进感觉信息的迅速传导, 从而有利于伤害性刺激信息迅速上传, 准确定位。脊髓神经元的传入活动受脊髓上神经元的调控［6～9］。 实验采用冷冻阻滞法在C5-6节段阻滞神经传导时, 发现4例深层会聚单位中有3例抑制间期不同程度缩短, Pe为条件刺激时缩短的幅度更大,提示上位中枢对Pe和Pu传入的相互抑制有促进作用, 且对Pe抑制Pu的促进作用更强。

关于时间依赖性抑制现象的发生机制有两种假说。Toney［4］和其他学者［10］支持突触前机制, 而对受体的研究则提示突触后机制［11-12］。 本实验观察到Pu和Pe分别作为条件刺激时产生抑制的刺激间期有显著差异,上位中枢的冲动对两者的影响也不同。 如果上位中枢或中间神经元对不同传入的调控发生在突触后, 则只能对不同来源的纤维产生非选择性作用,而突触前机制则可对不同来源的传入信息产生不同影响; 本实验记录到的躯体与内脏传入反应均为兴奋性, 可排除异源性传入直接相互抑制的可能,看来本实验的结果有利于突触前假说。

考虑躯体内脏信息相互作用时, 人们传统地认为躯体信息可影响内脏, 而很少认为内脏信息会影响躯体。 本实验发现, 在同等强度刺激下, Pe输入对Pu输入的抑制强于Pu输入对Pe输入的抑制。这似可提醒我们关注内脏刺激影响躯体输入这一非寻常现象。一方面,这一发现可对临床上见到的躯体功能紊乱模拟内脏疾