摘要：用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎(BCAO)前脑缺血模型, 研究缺血/再灌对海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响及NMDA受体(NR)非竞争性拮抗剂氯胺酮(ketamine, kT)、 L-型电压门控钙离子通道(L-type voltage gated calcium channel, L-型VGCC)拮抗剂硝苯吡啶(nifedipine, nD)及非NR拮抗剂6,7-二硝基喹恶啉上卫四(6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, DNQX)对其变化的影响。结果如下: (1)缺血15 min导致蛋白酪氨酸磷酸化水平明显下降, 再灌引起包括180 kD蛋白在内的多种蛋白酪氨酸磷酸化水平快速(再灌15 min)而持续(至少48 h)升高; (2) 脑缺血15 min, 再灌6 h, 蛋白酪氨酸磷酸化达最高水平, 180 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平为假手术对照组的1.8倍; (3)缺血前腹腔注射KT或ND, 对缺血/再灌诱导180 kD等蛋白酪氨酸磷酸化水平升高均有拮抗作用, 但DNQX无此作用; (4) 免疫沉淀和免疫印渍证明, 180 kD 蛋白为NR2B, 且其蛋白表达在脑缺血/再灌时没有变化。 结果提示, (1) 脑缺血/再灌诱导NR2B等蛋白酪氨酸磷酸化增加, 激活NR通道,加重神经元损伤; (2) NR通道不仅可被酪氨酸磷酸化调节, 而且NR通道和L-型VGCC都参与了脑缺血/再灌对NR2B等蛋白酪氨酸磷酸化水平的调节,两种通道拮抗剂可能对防治缺血性脑损伤有一定作用。脑缺血是一种发病率高, 危害严重的疾病, 缺血神经元损伤的机制日益受到人们的关注。脑缺血和缺血后再灌能引起一系列病理和生化的变化, 主要表现为脑能量耗竭,兴奋性氨基酸(EAA)释放增加, 胞内Ca2+超载, 细胞膜功能受损, 毒性自由基产生, 细胞肿胀, 凋亡和坏死等。脑缺血引起胞内Ca2+超载, 主要涉及EAA受体通道和L-型电压门控钙离子通道(VGCC)。其中缺血时EAA释放增加, 在脑缺血神经元损伤中起极重要的作用。按药理学特征, 亲离子型EAA 受体有两种类型: NMDA受体(NR)和非NR［1］,由于NR是配体门控性Ca2+ 通道, 对Ca2+ 有较强的通透性, 因此, NR家族在脑缺血损伤中的作用日益受到重视。分子克隆表明, NR由NR1和NR2(2A-2D)组成［1］, 正常情况下, NR由NR1和至少一种类型NR2亚基组成。NR1是该受体通道的功能部分,而NR2具有调节受体通道动力学作用。研究表明, 通过酪氨酸磷酸化可调节NR, 电生理实验发现, 酪氨酸蛋白激酶(PTK)可增强NMDA诱导的电流［2～5］,酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)作用正好相反［5］, 这种调节作用可能和NR通道本身的酪氨酸磷酸化有关［5］。但这种变化是否与NR通道和L-型VGCC两类Ca2+通道的过度激活而导致的Ca2+ 超载有关, 尚不清楚。我们用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎(BCAO)前脑缺血模型,研究沙土鼠脑缺血和再灌突触体蛋白酪氨酸磷酸化水平变化, 以及NR非竞争性拮抗剂KT、 L-型VGCC拮抗剂ND和非NR拮抗剂DNQX对其变化的影响。

1材料和方法

1.1动物成年健康蒙古沙土鼠, 体重60～80 g, 由徐州医学院实验动物中心提供。

1.2主要试剂牛血清白蛋白(BSA), DNQX, Tween-20, 氯胺酮, 硝苯砒啶, Leupeptin, Pestatin A,均为Sigma公司产品, 丙稀酰胺、 亚甲基双丙烯酰胺(E.Merck公司产品), Triton X-100 (Rohm-Haas公司产品),其余试剂均为国产分析纯。抗体: 磷酸酪氨酸单抗(PY20, Pharmigen), NR2B单抗, 羊抗鼠(兔)IgG-AP (Sigma)。

1.3蒙古沙土鼠脑缺血模型动物随机分为假手术对照组、 缺血/再灌组及给药组。缺血/再灌组腹腔注射水合氯醛(300～350 mg/kg 体重)麻醉后,其余操作按我室的方法［6］, 实验动物缺血成功与否以结扎后脑电波(EEG)是否消失作为主要指标。假手术对照组的麻醉及手术操作同上, 但不造成缺血;给药组缺血前20 min腹腔注射80～100 μl体积药物, 假手术对照组及缺血组给予相同体积的溶剂。缺血前控制动物体温在37～37.5℃, 缺血15 min后, 按实验要求再灌不同时间。 断头, 液氮速冻固定10 s, 60 s内取出双侧海马置于液氮中冻存。

1.4样品的制备参考Hu等人的方法［7］, 略有改动。以下操作均在4℃下进行。液氮冻存的海马, 按1∶10 (mg/μl)加入匀浆液A (mmol/L:50 MOPS, pH 7.4, 0.2 DTT, 100 KCI, 0.5 MgCl2, 1 Na3VO4, 0.1 EDTA, 1 EGTA, 0.5 ouabain, 以及50 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml pepstatin A和0.32 mol/L sucrose), Teflon匀浆器高速匀浆30 s×3, 离心800 g 10 min, 上清再以9200 g 离心15 min, 沉淀加入含0.1% Triton X-100匀浆液,超声破碎10 s×3次, 作为突触体样品液氮速冻后, 置于-80℃冰箱待用。

1.5免疫印渍测定磷酸酪氨酸蛋白［8］等量的样品蛋白(50 μg/lane)经7.5% SDS-PAGE分离后, 以湿转法电转至NC膜上(Amershan),条件为1 A电流90 min。转移缓冲液: 25 mmol/L Tris, 190 mmol/L 甘氨酸, 20%甲醇, 0.05% SDS。转移完毕后,加入封闭液: 1% BSA的buffer A (10 mmol/L Tris pH 7.5, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20),室温封闭3 h, 加入用封闭液稀释的一抗(磷酸酪氨酸单抗或NR2B单抗)4℃过夜, buffer A洗膜, 加羊抗鼠IgG-AP (1∶1000 buffer a稀释, Sigma), 37℃保温2 h于室温30 min后, buffer A 洗膜加入显色剂(NBT/NCIP 显色试剂盒, 华美公司),反应达到要求后, 流水洗涤终止反应。所得NC膜可直接用图像处理仪处理。

1.6免疫沉淀［9］免疫沉淀条件: 样品蛋白200 μg, 加入SDS和二硫代苏糖醇(DTT)至终浓度分别为0.5% 和 1 mmol/L, 煮沸5 min后, 用buffer B (20 mmol/L Mops pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% nonidet P-40, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 0.2 mmol/L sodium orthovanadate, 0.2 mmol/L PMSF) 稀释4倍。加入磷酸酪氨酸单抗2.5 μg基其他抗体, 4℃, 轻轻摇动4 h, 加入Protein A-Sepharose继续摇动4 h, 离心, 沉淀再用buffer B洗涤3次, 沉淀加2.5倍浓度的上样缓冲液(0.15 mol/L Tris-HCl pH6.8, 12.5% β-mercaptoethanol,6% SDS, 12.5 mmol/L EDTA, 10% glycerol, 0.05% bromphenol blue)煮沸10 min, 离心取上清,电泳7.5% SDS-PAGE, 其余操作方法同方法1.5。

1.7数据处理数据以 ±s表示, 成组设计的两组间均数比较采用t检验, 多组均数与同一均数的比较采用方差分析, p＜0.05和P＜0.01分别表示两组数据间有显著性差异和有非常显著性差异。

2结果

2.1脑缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的变化

沙土鼠前脑缺血15 min后再灌不同时间, 以抗磷酸酪氨酸单抗做免疫印渍。缺血15 min后,免疫印渍蛋白条带比假手术对照组明显减少、 减弱; 随着再灌时间的增加, 包括分子量为180, 120, 95, 60和42 kD等多种蛋白条带逐渐增加。再灌15 min, 上述各条带就已出现, 且也超过假手术对照组; 再灌6 h达到最大, 以后略有下降。特别是分子量为180 kD的蛋白条带变化更为明显, 再灌6 h,约为假手术对照组的1.8倍。

2.2KT对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响

脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予KT 12.5、 25、 50 mg/kg体重3种剂量。缺血15 min, 再灌6 h, 提取海马突触体,以抗磷酸酪氨酸单抗做免疫印迹。 缺血15 min, 再灌6 h后, 上述各种蛋白酪氨酸磷酸化均显著增加。条带用图像处理仪处理后, 180 kD蛋白为假手术对照的182%(P＜0.01)。各给药组蛋白酪氨酸磷酸化均有降低, 其中磷酸化的180 kD分别下降为假手术对照组的120%,117%和111%, 与假手术对照组相比, 皆有显著性差异(P＜0.05); 与缺血/再灌6 h组相比, 也有显著性差异(P＜0.05);但各给药组之间无显著性差异(P＞0.05)。

2.3ND对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响

脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予ND 10, 15, 20 mg/kg体重3种剂量。缺血15 min, 再灌6 h,各种蛋白酪氨酸磷酸化与上述结果相同, 其中180 kD为假手术对照组的183%(P＜0.01)。给药各组各种蛋白酪氨酸磷酸化均有下降, 其中180 kD蛋白酪氨酸磷酸化分别下降为假手术对照组的126%,121%, 115%, 3组与假手术对照相比, 皆有显著性差异(P＜0.05); 与缺血/再灌6 h组相比, 也有显著性差异(P＜0.05);但各给药组之间无显著性差异(P＞0.05)。

2.4DNQX对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响

脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予DNQX10, 20, 30 mg/kg体重3种剂量, 所得结果见图4, 由图4可见, 3组剂量的DNQX对蛋白酪氨酸磷酸化无显著性影响。其中酪氨酸磷酸化的180 kD蛋白分别为假手术对照组的182%, 181%和180%, 3组与假手术对照组相比, 皆有显著性差异(P＜0.05); 与缺血/再灌组相比,无显著性差异(P＞0.05)。

2.5免疫沉淀和免疫印渍鉴定NMDA受体亚基

本研究主要关注的是上述180 kD是否为NMDA受体亚基NR2B。因此, 我们采用抗磷酸酪氨酸单抗免疫沉淀缺血/再灌海马突触体蛋白, 电泳后转膜,再用抗NR2B抗体检测, 发现一条180 kD的磷酸酪氨酸蛋白条带(图5)。图6表示缺血/再灌后NR2B蛋白表达水平与假手术对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。

3讨论

实验表明, 沙土鼠前脑缺血/再灌可诱导海马突触体包括180 kD等多种蛋白酪氨酸磷酸化的增加; 这种增加可被NR拮抗剂KT和L-型VGCC拮抗剂ND所拮抗,而非NR拮抗剂DNQX则无此作用, 提示脑缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的增加与NR通道和L-型VGCC有关, 而与非NR通道无关;经免疫沉淀和免疫印渍鉴定, 180 kD蛋白含NR2B, 而且, 脑缺血/再灌引起其酪氨酸磷酸化增加最为显著, 大约为假手术对照组的1.8倍。

配基门控离子通道可逆磷酸<