摘要：为了探讨在内毒素作用下的乳鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs)血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)基因的表达及其在细胞损伤中的作用, 分别用 10、30及50 μg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide, lPS), 10 μg/ml LPS +10 μmol/ml锌原卟啉Ⅸ(Zn-protoporphyrin-Ⅸ, ZnPPⅨ)和单纯10 μmol/ml znPPⅨ与培养的NRCMs共同孵育6 h, 以及10 μg/ml LPS与NRCMs共同孵育9 h和18 h。分别观察细胞HO-1 mRNA表达、MDA含量、LDH释放量与台盼蓝摄取率的变化。结果显示, 同样与细胞孵育6 h, LPS 10 μg/ml时HO-1 mRNA表达比对照组增加81.2%, 30 μg/ml时表达量增加126.3%, 50 μg/ml时表达量增加92.8%; LPS为10 μg/ml时, 孵育9 h后HO-1 mRNA的表达量比对照组增加93.6%, 孵育18 h后表达量增加105.8%。LPS 30、50 μg/ml, 10 μg/ml LPS+10μmol/ml ZnPPⅨ与细胞孵育6 h及LPS 10 μg/ml孵育18 h后, 细胞MDA含量、LDH释放量与台盼蓝摄取率明显增加(P＜0.01);单纯10 μg/ml LPS与单纯10 μmol/ml ZnPPⅨ孵育6 h后, 上述指标均无明显升高。结果表明, LPS可诱导NRCMs HO-1 mRNA的表达, 且在较低LPS剂量范围内具有时间依赖性和浓度依赖性; NRCMs HO-1 mRNA的表达可减低LPS引起的细胞损伤,这可能是细胞产生的一种自身保护性反应。有人报道, 在多种病理条件下, 如发生心肌缺血再灌注损伤以及脓毒血症时[1,2], 心肌可诱导型血红素加氧酶(heme oxygenase-1, hO-1)含量及活性升高, 应用HO活性抑制剂后心脏功能下降, 因此认为HO在其中可能起抗损伤作用[3]。HO/一氧化碳(carbon monoxide, cO)通路作为在应激条件下心肌功能代偿和维持的重要调节通路日益受到人们的重视。但由于脓毒血症是由内毒素诱发并由众多炎性细胞因子参与的相当复杂的病理过程,心脏HO-1表达增多是否由内毒素直接作用于心肌细胞所致尚不清楚。本研究从细胞水平观察了LPS对体外培养的乳鼠心肌细胞HO-1 mRNA表达的影响,进一步探讨了HO/CO通路在内毒素性心功能障碍中的作用机制。

１材料和方法

1.1材料及试剂来源Wistar乳鼠由北京医科大学实验动物中心提供; 内毒素采用的脂多糖(LPS, WE.COLI 0127:B8)为DIFCO公司产品,十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)、锌原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)及三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于美国Sigma公司; DMEM、胰蛋白酶与胎牛血清购于美国GIBCO公司;异硫氰酸胍为Promega产品; 鼠HO-1cDNA探针(838bp)由NIH衰老研究所龙西林惠赠。其它试剂为市售分析纯。

1.2乳鼠心肌细胞的培养[4] 取出生1~3 d的Wistar乳鼠的心脏, 剪成1 mm3大小的组织块, 用0.125%胰蛋白酶消化、离心收集细胞,加入含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM, 置于37℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育2 h, 用差速贴壁法除去非心肌细胞。收集细胞悬液,配成1×106细胞/ml的悬液,然后按5 ml/瓶加入到50 ml培养瓶中,置于37℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养。在培养的最初两天, 加入0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿嘧啶核苷,以抑制非心肌细胞的生长。用上述方法培养的细胞镜下可见粗糙的颗粒状胞浆和小的浓缩核, 证明绝大部分细胞为心肌细胞,符合实验要求。实验前24 h将悬液换成不含血清的DMEM, 使细胞处于静止状态。

1.3实验分组培养1周的乳鼠心肌细胞48瓶(每瓶5×106细胞)随机分为8组, 每组6瓶。(1)对照组: 常规DMEM培养, 不加LPS, 分别孵育6、9和18 h, 因结果无统计学差异而合为一组; (2)低剂量组(L, 6 h): LPS 10 μg/ml; (3)中剂量组(M, 6 h): LPS 30μg/ml;(4)高剂量组(H, 6 h): LPS 50 μg/ml; (5)抑制剂组(L+I, 6 h): LPS 10 μg/ml+10 μmol/ml ZnPPⅨ;(6)单纯抑制剂组(I, 6 h): 10 μmol/ml ZnPPⅨ, 以上5组均孵育6 h; (7)9 h组(L, 9 h): LPS终浓度10 μg/ml,孵育9 h; (8)18 h组(L, 18 h): LPS终浓度为10 μg/ml, 孵育18 h; LPS与 ZnPPⅨ预先配成母液, 细胞换液后加入到DMEM中使之成为相应的终浓度。

1.4生化指标测定取各组培养液, 用Lowry法测定蛋白浓度, 硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量, 乳酸基质法测定LDH活性。

1.5台盼蓝摄取率测定20 μl细胞悬液加等体积0.4%的台盼蓝溶液,37℃孵育3 min后显微镜下计数。

1.6Northern印迹杂交用0.125%的胰酶消化, 离心后收集细胞。用异硫氰酸胍裂解一步法提取NRCMs总RNA, 取20 μg总RNA经甲醛变性凝胶电泳分离后转移至尼龙膜上,先预杂交, 然后用 α-32P-dCTP标记的鼠HO-1cDNA变性探针与固定在尼龙膜上的RNA进行杂交, 以 β-actin探针杂交做内参照,按常规方法洗膜, 于－20℃放射自显影。以图像分析仪(LEICA Q550IW, 德国)测定各杂交带光密度值与面积, 计算积分光密度(I.OD)及与内参的比值。

1.7统计学处理全部数据用mean±SE表示, 采用One-way ANOVA软件分析进行组间比较, 继而用q检验进行两组间的比较。P＜0.05为差异有显著性, p＜0.01为差异有高度显著性。

2结果

2.1LPS作用下NRCMs台盼蓝摄取率与LDH释放量的变化

低剂量LPS及单纯抑制剂与NRCMs孵育6 h及低剂量LPS孵育9 h, 与对照组相比, 细胞台盼蓝摄取率与LDH释放量无明显变化;中剂量、高剂量LPS及低剂量LPS加抑制剂与NRCMs孵育6 h和低剂量LPS孵育18 h, 台盼蓝摄取率与LDH释放量明显增加。

2.2LPS作用下NRCMs MDA含量的变化

低剂量LPS及单纯抑制剂与NRCMs培养6 h和低剂量LPS孵育9 h, MDA含量与对照组相比无明显增多,差异无显著性。中剂量、高剂量LPS与低剂量LPS加抑制剂与NRCMs孵育6 h和低剂量LPS孵育18 h, MDA含量明显增加(表1), 提示NRCMs细胞膜脂质过氧化增强。

2.3HO-1 mRNA表达

诱导NRCMs表达HO-1。10 μg/ml LPS与NRCMs共同孵育6 h NRCMs HO-1 mRNA表达量比对照组增加81.2%,随着LPS浓度的增高NRCMs HO-1 mRNA表达量逐渐增多。 30 μg/ml时, NRCMs HO-1 mRNA表达量达到高峰,为对照组的226.3%; 50 μg/ml时, NRCMs HO-1 mRNA表达量基本降至低剂量时的水平; 10 μg/ml LPS与NRCMs共同孵育时,随时间的延长NRCMs HO-1 mRNA表达量逐渐增多, 9 h 组的HO-1 mRNA表达量为对照组的93.6%, 18 h组的HO-1 mRNA表达量为对照组的205.8%

3讨论

近年来, HO及其催化产物的抗氧化损伤作用日益受到人们的重视[5]。体内HO存在两种亚型,即HO-１和HO-２, 分别为不同基因表达的产物。HO-1为可诱导型,是传统意义上的血红素加氧酶, 其活性除受血红素调节外, 多种非血红素类物质,如重金属盐(铬盐、钴盐)、激素、内毒素和炎性细胞因子等以及缺氧、热休克等因素也可诱导其产生[6]。HO-2为结构型表达, 其活性在生理状态下受糖皮质激素的调节,应激反应不能诱导其产生[7]。HO-１和HO-２均催化血红素降解生成胆绿素、CO和铁,胆绿素在其还原酶的催化下变为胆红素。其中胆绿素和胆红素均为较强的抗氧化剂。已有研究证明,心肌缺血再灌注等应激反应均能使心脏HO-1表达增多并显示其抗氧化损伤作用[8]。

脓毒血症以内毒素血症、心功能障碍和低血压为特征。我们先前在应用盲肠结扎穿孔法复制的大鼠腹膜炎脓毒血症模型上发现, 术后9 h心脏HO-1 mRNA表达明显增多, hO酶活性明显升高, 此时心脏功能并无明显变化[3]。上述研究提示, HO/CO通路活性增强可能参与脓毒血症早期机体抗损伤机制的形成,但由于脓毒血症是由内毒素诱发并由众多炎性细胞因子参与的相当复杂的病理过程, 心脏HO-1表达增多是否由内毒素直接作用于心肌细胞所致尚不清楚。

本研究采用体外培养的乳鼠心肌细胞, 探讨LPS诱导心肌细胞 HO-1表达的规律与作用, 进一步探讨HO在LPS介导的心肌功能障碍中的作用与机制。结果显示, lPS对心肌细胞具有双重作用。LPS作用下NRCMs LDH释放量与台盼蓝摄取率增加, 表明LPS可造成细胞损伤, 使细胞活性降低, 而MDA含量的增加表明LPS引起的细胞损伤与细胞膜脂质过氧化增强有关。另一方面, lPS作为一种应激因素可诱导心肌细胞HO-1 mRNA表达, 其表达量在较低LPS浓度范围时具有浓度依赖性和时间依赖性; 当LPS浓度过大如增至50 μg/ml时,由于细胞损伤过重致HO-1表达降低。为了探讨HO-1的产生与LPS介导的细胞损伤之间的关系, 我们特设了小剂量LPS (10 μg/ml)加抑制剂组和单纯抑制剂组,均与NRCMs孵育6 h。结果显示, 小剂量LPS与抑制剂同时和NRCMs孵育, 则细胞出现明显损伤, 而在单纯小剂量LPS组和单纯抑制剂组细胞并无明显损伤,结合小剂量LPS引起NRCMs HO-1 mRNA表达明显增多和ZnPPⅨ对HO活性的特异性抑制作用, 提示HO-1可能减低了LPS介导的细胞损伤,其机制可能与降低细胞膜脂质过氧化有关。这可能是在LPS作用下的心肌细胞产生的一种自身保护性反应。LPS对心肌细胞的这种作用特征可能介导了脓毒血症时内源性保护机制的形成。可以想象,在脓毒血症早期, LPS浓度较低, 诱导心肌细胞HO-1 mRNA表达不断增多、酶活性亦不断增强,从而通过催化大量的血红素降解生成大量的胆绿素和胆红素而发挥强大的抗氧化损伤作用, 因此基本维持心脏功能的正常水平。但随着脓毒血症病程的延长,体内LPS不断集聚, 当其浓度增大到一定程度时就会对心肌细胞产生不可逆的损伤, 从而导致HO-1 mRNA表达降低、HO-1的保护作用降低,心功能随之下降[3]。

总之, 本研究显示, LPS可诱导乳鼠心肌细胞HO-1的表达,且在低剂量范围内具有浓度依赖性和时间依赖性。LPS刺激心肌细胞表达HO-1增多可能是机体的一种自身保护性反应机制。

参考文献

[1]Laubach VE, Foley PL, S