摘要：我们的前期工作表明, 不育症人精液中纤溶酶原激活因子(plasminogen activator; PA)活性明显升高;给成年男子和猕猴注射长效睾酮诱发无精过程中, 精液PA含量也伴随上升。为进一步查明PA的来源和对精子的作用, 用原位杂交检测组织型PA (tPA),尿激酶型PA (uPA)及PA抑制因子-1 (PAI-1) 的mRNAs在成年健康猕猴附睾、 前列腺和精囊中的表达。体外培养猕猴精子, 培液中加入uPA、 tPA及其底物纤溶酶原(plasminogen), 测试PA对精子活力、 顶体反应及激活卵子的影响。结果表明, 猕猴附睾、前列腺和精囊均表达tPA、uPA和PAI-1 mRNAs。加入uPA能维持精子的活力, 使精子产生超激活运动, 诱导顶体反应的发生, 并使精子获得激活卵子的能力。这说明猕猴精浆PA除来源于睾丸外,可能主要来源于附睾及附性腺; 在体外, uPA, 而不是tPA, 可能诱导精子获能。纤溶酶是一种具有广泛活性的胰蛋白酶样蛋白水解酶, 在细胞外蛋白水解中发挥重要作用[1]。纤溶酶原激活因子(plasminogen activator; pA)可特异激活纤溶酶原, 使其转化为有活性的纤溶酶。灵长类精浆中含组织型PA (tPA)和尿激酶型PA (uPA)[2],但精浆PA的来源及生理意义并不清楚。有证据表明, 睾丸和附睾可表达tPA和uPA[3,4], 精浆tPA可参与精液液化[5],少精症和弱精症的发生常伴随精浆tPA和uPA的含量和活性升高[2]。uPA可与精子膜上的受体结合, 精子膜结合uPA的量与精子的活力和受精能力呈正相关,提示uPA可影响精子的运动及受精[6]。精子的活力和受精能力与精子获能密切相关, 提示uPA可能参与精子获能。目前对精子获能的机制尚不完全清楚,因而不能得到获能的确切定义和评判标准, 但主要以精子受精和顶体反应评价获能。 另外,精子的超激活运动也与获能相关[7,8]。本实验从上述三方面评价精子获能。卵受精后形成二原核并分裂既与精子获能又与卵母细胞的细胞质成熟相关。因此,在体外受精实验中, 我们以将精子穿透并激活卵母细胞来评价精子的受精能力。

１材料和方法

1.1实验动物及主要试剂成年雄性猕猴来自中国科学院昆明动物研究所实验动物中心。猴tPA、 uPA和PAI-1 cDNA质粒由瑞典Umea大学Ny教授赠与,雄激素受体(AR) cDNA质粒由上海生物化学研究所张永莲教授惠赠。RNA标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司(北京), rNA聚合酶T7和SP6购自Promega公司(北京), 多聚赖氨酸购自华美公司(北京)。其余试剂均购自Sigma公司。

1.2原位杂交猕猴附睾头部、 体部、 尾部、 精囊及前列腺制作石蜡切片(6μm)。切片贴附于0.1%多聚赖氨酸处理的载玻片上。切片脱蜡后在空气中干燥。室温下固定(4%多聚甲醛/PBS, pH 7.5), 20 min后,洗去固定液(PBS洗涤3次, 过蒸馏水), 作酸水解处理(0.2 mol/L HCl, 25 min)及去膜处理(0.3% Triton X-100/PBS,15 min)。 PBS洗涤3次后固定5 min, 洗去固定液, 作去电荷处理(0.1 mol/L三乙醇胺/0.25%乙酸酐)15 min。40℃预杂交(2×SSC/50%甲酰胺; 20×SSC: 3 mol/L NaCl/0.3 mol/L柠檬酸纳, pH 7.0) 2 h后, 与tPA、 uPA、 PAI-1及AR正义或反义dig-cRNA探针(100 ng/ml溶于IHS中; HIS: 2×SSC/50%甲酰胺/10 mol/L Tris, pH 7.5/250 μg/mL酵母tRNA/0.5% SDS/1×Denhardt′s)45℃杂交20 h, 杂交结束后顺序洗涤:2×SSC,2×1 h,37℃; 1×SSC,2×15 h,37℃; 0.1×SSC,2×15 min,40℃。Dig-cRNA用碱性磷酸酶标记的anti-dig fab抗体检测(操作按The DIG System User′s Guide for Filter Hybridization), 待显色满意后, 用0.1 mol/L EDTA终止反应,过蒸馏水,甘油封片,明视野显微记录。

1.3猕猴精子的采集和培养盐酸氯氨酮麻醉猕猴后, 用阴茎电刺激方法采精[9]。精液在室温或37℃水浴中液化半小时, TALP-HEPES液洗3次,检测精子浓度, 活率和活力。以2×107活动精子/ml培养在2 ml TALP 液中, 培液上覆盖硅油, 于37℃ 5％ CO2-95%空气及饱和水蒸气中培养。

1.4体外PA对精子活力的影响咖啡因和dbcAMP是猕猴精子体外获能时常使用的获能物质, 能使精子快速运动及超激活运动,本实验将其作为刺激精子运动的阳性对照。PA的作用底物plasminogen在精子洗涤后含量减少,因此我们在测试PA的同时加入plasminogen。精子分为4组培养: a) 阴性对照组, 培养液中不加任何物质; b) tPA组, 精子在TALP液中培养4~7 h后, 培液中加入tPA (5 mmol/L)和底物plasminogen (1 mmol/L); c) uPA组, 精子在TALP液中培养4~7 h后, 培液中加入uPA (20 IU/ml)和底物plasminogen (1 mmol/L); d) 阳性对照,精子在TALP液中培养4~7 h后, 培液中加入咖啡因和dbcAMP, 两者浓度为1 mmol/L[10]。 a、 b和c组以加入PA为0 h, 每5 h取部分精子, d组在加入咖啡因和dbcAMP 1.5 h后取精子。采用压片法, 在低倍镜下随机选择10个视野, 检测精子的活力, 按WHO推荐的方法分为4级: a级, 精子呈快速活泼的直线前向运动; b级, 精子能活动, 但方向不明确, 呈快速或迟钝的直线或非直线前向运动; c级, 精子活动不良, 原地打转或旋转运动,前向运动能力差; d级, 精子不活动。精子出现8字运动视为超激活运动。

1.5uPA对体外精子顶体反应(AR)的影响咖啡因和dbcAMP是猕猴精子体外获能物质, 能诱导精子获能并发生AR, 因而将其作为阳性对照,培养精子在没有任何刺激因子存在下产生的自发性AR则作为阴性对照。精子分为3组培养: (1) 阴性对照组, 培养液中不加刺激因子; (2) uPA组,精子在TALP液中培养4~7 h后, 培液中加入uPA (20 IU/ml)和底物plasminogen (1 mmol/L); (3) 阳性对照组,精子在TALP 液中培养4~7 h后, 培液中加入咖啡因和dbcAMP, 两者浓度为1 mmol/L。第1和2组精子以加入uPA为0 h计, 每5 h取部分精子, 第3组精子则在咖啡因和dbcAMP作用1.5 h后取样。精子用PBS洗3次(10?000 g, 5 min), 涂片,空气干燥后用FITC-PSA荧光染料(2 μg/ml)在37℃饱和水蒸气中孵育染色30 min[11], 蒸馏水洗去非特异性荧光染料,风干后立即在荧光显微镜下观察。发生顶体反应的精子, 头部不能着色, 荧光视野下仅能见赤道板以下部分。相反,则能在荧光下显示完整的精子。按下列方法计数发生顶体反应的精子: 随机选择3个视野, 首先在荧光视野下计完整精子数目, 重复2次,然后在普通光镜视野下计完整精子数, 重复2次, 分别取2次计数的平均值作为精子数,两种光视野下的精子数之差即为该视野中发生AR的精子数。三个不同视野的精子顶体反应百分率的平均值为该样品精子的顶体反应百分率。

1.6uPA对体外精子激活卵子的影响49个体外成熟的猕猴卵母细胞用于体外受精, 卵随机与下列精子共同培养[10]: (1) 阴性对照,未经任何物质作用培养的精子(12个卵); (2) uPA作用10 h的精子(12个卵); (3) uPA作用25 h的精子(11个卵); (4) 阳性对照,咖啡因和dbcAMP获能后的精子(14个卵)。3~5个卵/100 μl受精液, 精子浓度为104/100 μl。精卵在受精液中共同孵育12~16 h后,卵用Hoechst 33342染色, 在荧光显微镜下观察, 具两原核或两极体的卵为被激活的卵。

1.7数据处理所有实验至少重复3次。顶体反应及精子体外受精实验中, 组间差异用方差分析(ANOVA)及最小显著差数法(LSD)分析, p＜0.05为差异显著。其余所示图片是3次相同实验结果的一次典型代表。

2结果

2.1tPA、uPA、PAI-1和AR mRNAs在正常猕猴附睾、前列腺和精囊中的表达

如图1A~T所示, 正常猕猴附睾头(A~D), 附睾体(E~H), 附睾尾(I~L), 前列腺(M~P)和精囊(Q~T)的上皮细胞都表达tPA、 uPA、 pAI-1和AR的mRNAs, 这说明猕猴精液中tPA、 uPA及PAI-1不仅来源于睾丸, 也可能来源于附睾, 前列腺和精囊的分泌液。

2.2tPA、uPA对体外精子活力的影响

精子膜可结合uPA和plasminogen[2,6,12]。由于本实验不能完全去除精子结合的内源性uPA和plasminogen,因而将PA和底物plasminogen同时加入精子培液。

阴性对照组精子随着培养时间的延长, 其活力和活率逐渐降低, 在培养约36 h后, 大部分精子活力降至d级。与阴性对照组比较, 培液中加入tPA不影响精子活力,但加入uPA可维持精子的活力, 并使精子产生超激活运动。uPA作用约10 h后, 精子开始头对头凝集并快速运动, 未凝集的单个精子中少量呈超激活状态,相似于咖啡因和dbcAMP作用后的精子, 并且精子的凝集和超激活随uPA作用时间的延长而加剧。咖啡因+dbcAMP作用约1~1.5 h后, 精子开始头对头凝集,并呈超激活运动。我们的工作已证明, 培液中单独加入plasminogen不影响精子的活力(未列入本实验), 从而排除了plasminogen单独起作用的可能性,肯定了精子活力的维持及运动方式的改变是由uPA引起, 但是否通过plasminogen产生的酶解途径并不清楚。

2.3uPA对体外精子顶体反应的影响

uPA可使少量培养精子产生超激活运动, 超激活运动与精子获能密切相关, 这提示我们进一步检测uPA在精子体外获能中的可能作用。

3组精子的顶体反应如图2。阴性对照组精子可产生约2%的自发性顶体反应。精子在uPA作用10 h时, 其顶体反应率已经显著高于阴性对照组,表明uPA作用约5~10 h能诱导精子发生顶体反应, 但其效率低于dbcAMP和咖啡因(阳性对照)。uPA诱导以及精子自发的顶体反应主要发生在uPA作用约10 h后, 其原因尚不清楚。由于精子获能具非同步性, 因而顶体反应的发生率随时间而逐渐增加, 在25 h后达到最大值。

2.4uPA对体外精子激活卵子的影响

精子的受精能力与其顶体反应呈正相关, 因而我们选择了uPA作用10 h (顶体反应率较低)以及25 h (顶体反应率最高)的精子进行体外受精, 并相应地取未经任何物质刺激的培养精子作为阴