摘要：利用内皮细胞流动小室方法,对大鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用下细胞内粘附分子-1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1 )的表达进行了研究。图像分析结果提示, 脑微血管内皮细胞在剪切力作用下ICAM-1的表达呈特异上调, 且存在着时间依赖性,与一定范围内的剪切力强度无关。用对细胞施加剪切力作用后提取上清液孵育内皮细胞的方法证明: 剪切力对鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1表达的影响,是直接作用于内皮细胞引起的细胞内的直接反应, 而不是剪切力导致细胞先释放细胞因子,释放的细胞因子再引起ICAM-1变化的间接反应。该工作为进一步开展剪切力对微血管内皮细胞信号转导机制的影响提供了实验数据。血管内皮细胞的功能日益引起人们的重视。它一方面通过分泌多种细胞活性物质, 如前列环素、内皮素等发挥其功能; 另一方面, 内皮细胞与血细胞之间相互作用,在血流动力学因素作用下参与体内许多病理生理过程,如动脉粥样硬化、血管内血栓形成等[1]。细胞粘附分子在血管疾病发病机理中起的作用越来越引起重视[2]。虽然已有学者对来自各种动物种类和组织来源的内皮细胞的细胞内粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)在剪切力作用下的表达规律作了大量研究, 如 Tsuboi等[3]发现,人脐静脉内皮细胞上ICAM-1的表达规律为, 在15 dyn/cm2的剪应力作用下1 h ICAM-1的含量即有显著增加,8 h后达到最高峰,因而ICAM-1的表达与剪应力有时间和强度相关性; 而大鼠淋巴管内皮细胞在剪应力作用下其ICAM-1的表达量却没有变化[4]。但迄今为止,还没有研究者对大鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1表达的规律作出定性定量的结论。我们以前曾研究过脑缺血再灌注下大鼠内脏的血流变特性[5],发现它有特殊的血流变表现规律。故本实验以鼠脑微血管内皮细胞为实验对象, 研究其在剪切力作用下ICAM-1表达特异的变化规律,以及ICAM-1在细胞识别剪切力信号并作出相应反应的机制中所起作用的内在机制。这对于进一步认识流动剪切力对微血管内皮细胞的功能、代谢等方面产生的影响以及心脑血管疾病的发病机制等都有重要的意义。

１材料和方法

1.1脑微血管内皮细胞的培养一月龄雄性SD大鼠(中国人民解放军总医院动物中心提供)用6%水合氯醛行腹腔麻醉。断头后无菌条件下剥离软脑膜及大血管,尽量去除大脑白质及小脑, 收集大脑皮质, 充分剪碎、匀浆后过170 μm及80 μm尼龙滤网, 收集滤网上的血管段, 1?500 r/min离心10 min,收集沉淀的血管段加入0.1% Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)消化15 min, 再经离心、D-Hank′s液冲洗、沉淀2次后加入内皮细胞培养液,将其植入1%明胶覆盖的培养皿中, 培养液为含30%小牛血清(杭州四季青公司)的M199(Sigma公司)。培养皿置于37℃恒温的5%CO2 中。

培养箱(TE-HER, 日本)中孵育1 h后换液, 之后每3 d换培养液1次, 至细胞长成融合单层。待细胞融合达80%后, 消化传代于8 mm×8 mm的盖玻片上, 传代后4~7 d左右用于实验[6]。

培养的脑微血管内皮细胞采用三个标准鉴定: (1)在倒置相差显微镜下细胞呈卵石样形态; (2)Ⅷ因子相关抗原检测阳性;(3)用凝集素亲和组织化学方法观察麦胚凝集素(WGA, Dako公司)在细胞上的表达为阳性。此外,在血管分离时采用的两种不同孔径的滤网及剥离操作限定了消化的血管在微血管的范围。

1.2流动小室的实验装置参考Stephen-G等人[7]的实验装置并加以改进。装置由上下两层有机玻璃制成, 下层中央有一个10 mm×10 mm×0.2 mm的正方形槽, 可放置长满内皮细胞的盖玻片。槽上方有一个60 mm×14 mm×0.4 mm的长方形槽, 与上层有机玻璃共同形成灌流液流动的通道,通道两端各开一个出口用于注入灌流液。上下层有机玻璃之间用医用乳胶垫密封。

对于平板槽流, 剪切力τ与流量Q及流室几何尺寸的关系为: τ=6ηQ[]wh2 . (1)式中: η为循环液粘度, Q为循环液流量, w为流室宽度, h为流室高度。在本实验中, η=0.0075 Pa.s, w=1.4 cm, h=0.04 cm, 因此剪切力τ与流量Q的关系为: τ=0.3348 Q.(2)单位: τ: dyn/cm2, Q: ml/min。

1.3实验系统的构成整个实验系统由流动小室、恒流泵、医用硅胶管道、储液瓶构成。灌流液由恒流泵泵出后经管道流入流动小室, 对内皮细胞施加剪切力后,再经管道回到储液瓶中。整套系统置于37℃恒温的CO2培养箱中。灌流液使用无血清的D′Hanks液, 从冰箱中取出后置于37℃恒温的CO2培养箱中过夜,然后再使用。

1.4内皮细胞ICAM-1的染色方法免疫组化染色方法参照ABC试剂盒(美国Vector公司)使用说明。

1.5实验设计原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞传代于0.8 cm×0.8 cm的盖玻片上, 传代3 d左右细胞铺满。在无菌条件下将盖玻片取出,放在流动小室中进行实验。灌流液为40 ml, 含20%小牛血清的M199培养液, 粘度为0.75 mPa.s。每次实验同时设正常对照组(0 h)。通过控制循环装置的流量调节作用于细胞上的剪切力。实验所用剪应力分别为0.20 dyn/cm2、 0.40 dyn/cm2,作用时间分别为0.5、1、4、6和8 h。(剪应力大小的选择建立在预实验基础上, 使之既对细胞产生作用, 又不会对细胞造成过度损伤而导致脱落过多)。

在细胞上清液实验中, 0.20 dyn/cm2剪应力作用内皮细胞6 h, 收集循环液1?500 r/min离心10 min, 取上清液室温下孵育铺满细胞盖玻片6 h, 对照组以正常循环液代替离心液孵育细胞。

在剪切力作用后, 取出盖玻片进行ICAM-1免疫组化染色。染色结果在显微镜下观察、照相并进行计算机图像分析。

1.6结果判断和图像分析阳性结果为胞膜棕黄着色, 每个样本随机选取三个视野, 运用Image Pro-Plus (美国Media Cybermetics公司)图像分析软件将彩色图像转变成黑白图像,测量视野内所有内皮细胞胞膜的灰度值, 除以细胞的个数, 得到单个内皮细胞胞膜的平均灰度值, 结果以平均值±标准差表示。统计分析的标准差按下式计算: s=1[]n∑n[]i=1(xi-x)2 . (3)χi: 样品值; x: 平均值; n: 实验样品数。

2结果

对照组内皮细胞略有淡黄着色, 灰度值较高(图3)。剪切力作用后半小时, 细胞着色即显著加深, 灰度值明显下降(P＜0.05), 在作用时间为4 h时,灰度值降到最低, 表示ICAM-1的表达量达到最高点(图4)。而在6 h时间点, 灰度值开始回升, 表示ICAM-1表达量开始下降。剪切力作用到8 h时,灰度值继续升高, 表示ICAM-1含量仍然下降。而大小不同的两组剪切力作用相同时间后灰度值比较无显著性差异,说明在剪切力作用下鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1含量的变化与作用强度无关。

实验结果表明, 剪切力作用6 h后,细胞的离心上清液孵育细胞ICAM-1的平均灰度值(151.91±4.20)和正常循环液孵育细胞ICAM-1的平均灰度值(148.27±3.63)没有显著性差异,说明鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1表达量的增高不是由于细胞受力作用后释放到体液中的蛋白大分子起的作用, 而是由剪切力作用产生的细胞内反应决定的。

3讨论

在哺乳动物血管系统中, 最里面的一层是内皮细胞层。这层细胞在其整个生命过程中, 将始终受到血管中流动血液的流体力学作用。这一力学作用持续时间之长, 强度之大,远非其它部位可以相比。这样, 内皮细胞对流体力学作用的响应性, 一方面成为该类细胞对相应生理改变控制的一个重要因素, 同时,也是心脑血管性疾病的病因学中一个不容回避的问题。

我们的研究发现, 不同于其它动物和组织的内皮细胞, 鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用后ICAM-1的表达呈现特有的规律。在剪切力作用半小时后其含量即有显著上升,在4 h左右达到高峰, 而在随后其含量又呈现下降的趋势。ICAM-1的表达量与剪切力的强度无关。而Tsuboi等[3]对人脐静脉内皮细胞上ICAM-1表达的研究表明,剪切力作用1 h以后ICAM-1才有显著的增加, 高峰期在 8 h 左右出现,鼠脑微血管内皮细胞上ICAM-1表达增加和高峰出现的时间都要早于脐静脉内皮细胞。这可能是因为微血管内皮细胞与大血管内皮细胞相比, 其对剪切力的作用特别敏感,微小的剪切力足以启动引起ICAM-1变化的信号传导途径, 因此剪切力的强度增加对ICAM-1的表达影响不大。

我们的研究还发现, 剪切力作用后的细胞上清液不能明显改变鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1的表达量,说明剪切力导致的ICAM-1含量的变化很有可能是剪切力直接作用于内皮细胞产生的细胞内效应的结果, 而非首先引起细胞生化改变, 产生释放的细胞因子,再引起ICAM-1含量的变化。剪切力导致了细胞的形变, 细胞骨架在其中起了重要的作用。体内体外实验证明, 剪切力对细胞骨架的F-actin的结构有着重要的影响。Carpen等[8]的实验表明, 含肌动蛋白的细胞骨架和ICAM-1有着直接的联系[9], actinin是一种与肌动蛋白相连的胞质蛋白,它与ICAM-1的胞膜内区域段相连并存,极有可能是连接ICAM-1和微丝网状结构的连接体。我们的研究发现ICAM-1的升高不是由细胞受剪切力作用后释放的细胞因子导致的,这使我们设想内皮细胞ICAM-1增高的可能途径是剪切力首先引起细胞骨架变化, 而细胞骨架再通过某种信号传导途径引起ICAM-1变化。探明这种信号传导途径,将为防治动脉粥样硬化等心脑血管疾病提供有意义的思路。

**感谢丹麦Aalborg 大学医学院医学与哲学博士Hans Gregerson 教授对本文提出的有益意见。

参考文献

[1]Fung YC, Liu SQ. Elementary mechanics of the endothelium of blood vessels. J biomech Eng, 1993, 115 (1): 1~12.

[２]Kaul DK, Liu XD, Nag