摘要：在16只切断两侧缓冲神经的大鼠, 观察颈总动脉注射辣椒素对脑干内心血管活动相关核团c-fos原癌基因表达的影响。在溶剂对照组大鼠脑干, 仅见少数Fos蛋白样免疫反应(FLI)神经元。与对照组相比,颈总动脉注射辣椒素(10 μmol, 0.1 ml)时, 脑干内巨细胞旁外侧核(PGL)、蓝斑(LC)、最后区(AP) 和孤束核(NTS)等部位的FLI神经元显著增加,而中脑中央灰质(PAG)和中缝核群(RN)的FLI神经元则无明显改变。应用辣椒素受体阻断剂钌红(RR; 200 mmol, 0.1 ml),可明显抑制辣椒素的上述效应。以上结果提示, 辣椒素可通过激活辣椒素受体(VR), 引起脑干内多个心血管活动相关核团的神经元兴奋, 但对PAG和RN无影响。延髓腹外侧头端区(RVLM)是维持和调节血压的关键部位,它和脑干内参与调控心血管活动的神经核团有广泛的联系。辣椒素是辣椒中的主要辛辣成分。Quest等［1］给猫第四脑室或延髓腹外侧化学敏感区注射辣椒素，导致血压和心率明显增加; seller等在给猫椎动脉内注射或RVLM区微量注射辣椒素时, 观察到血压升高和交感神经活动增强;辣椒素受体阻断剂 (capsazepine, CPZ) 和钌红(ruthenium red, RR)可明显抑制这一效应［2］ 。 Lukovic 等将辣椒素微量注射于大鼠孤束核(NTS),则引起血压降低和心率减慢［3］。我们实验室的前一研究表明, 颈动脉内注射辣椒素引起RVLM神经元自发放电频率增高, RR可明显抑制此效应［4］。 以上资料提示,辣椒素对 RVLM 神经元及相关核团神经元活动有影响, 但这一影响是其直接作用于RVLM区神经元, 还是作用于相关核团后再继发地导致该区神经元变化,或两者兼有, 目前尚未澄清。神经元内Fos蛋白的表达可作为神经元兴奋的指标［5］。已有资料表明, 辣椒素是较强的化学刺激物,在注射于小脑延髓池内时可诱发三叉神经核(TNC)、 NTS、 最后区(AP)等部位Fos蛋白的表达［6］。本研究旨在应用Fos蛋白的免疫组织化学技术,观察一侧颈总动脉注射辣椒素时脑干内心血管活动相关核团Fos样蛋白的表达, 以进一步论证其作用部位。

实验选用雄性的Sprague-Dawley大鼠,体重280～300 g, 用25%氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg)腹腔麻醉。所有动物在实验当天的同一时间取出, 捉拿动物时尽可能动作轻柔。在实验过程中, 将动物置于柔软的实验台上, 保持室温恒定和周围环境安静,避免不必要的刺激。实验分为4 组: (1) 空白对照组(n=3): 待动物麻醉后2 h, 经主动脉插管灌注生理盐水150 ml, 继之用4%多聚甲醛(pH7.4, 4℃) 300 ml灌注固定后, 迅速取出脑干。(2) 溶剂对照组(n=3): 待动物麻醉后, 行颈部正中切口, 切断双侧缓冲神经。一侧颈总动脉插管,注射生理盐水(0.1 ml)。在注射期间, 按常规方法［4］连续记录动脉血压和心率。2 h后灌注固定, 过程同上组。(3) 辣椒素组(n=5):一侧颈总动脉注射辣椒素(10 μmol, 0.1 ml), 其余过程同(2)组。 (4) 钌红-辣椒素组(n=5):一侧颈总动脉注射辣椒素受体阻断剂钌红(200 mmol, 0.1 ml), 5 min后再注射辣椒素(10 μmol, 0.1 ml),其余过程同(2)组。脑组织取出后, 置于4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液中, 4℃ 4～6 h, 再转入30%蔗糖溶液中,置4℃冰箱内36 h,用恒冷切片机对脑干行冠状连续切片,厚度40 μm, 每隔4张切片取1张, 用ABC法进行Fos免疫组织化学反应。切片先用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗3次, 5 min/次; 在3% H2O2 (溶于甲醇中)中室温孵育30 min, 以消除内源性过氧化物的活性。在PBS中浸泡5 min。加入5%正常山羊血清和3% triton X-100, 37℃ 60 min; 去血清免洗, 在1∶500稀释的一抗中, 37℃孵育60 min, 再置于4℃冰箱内 48 h。用PBS冲洗3次, 5 min/次; 滴加1∶300 稀释的生物素标记的二抗, 37℃孵育60 min。以PBS冲洗3次, 5 min/次;加入1∶300稀释的辣根酶标记的链霉卵白素, 37℃孵育60 min。用PBS冲洗3次, 5 min/次; 将切片贴于载物片上, 以0.05% DAB显色5 min, 蒸馏水冲洗中止反应, 常规脱水、 透明和封片后, 按Paxinos和Watson大鼠脑图谱［7］, 于光镜下检测FLI神经元,并做神经元计数。4%多聚甲醛、30%蔗糖溶液、 PBS、 生理盐水于实验时新鲜配制, 辣椒素和RR均为Sigma产品, Fos抗体为美国Santa公司生产的兔多克隆抗体。

数据输入计算机进行统计学处理, 全部用x±s表示, 不同组别的FLI神经元数行组间t检验。

实验结果如下:

1.颈总动脉注射辣椒素对动脉血压和心率的影响

颈总动脉注射生理盐水0.1 ml或钌红(200 mmol,0.1 ml), 平均动脉压 (MAP)、 心率（HR）均无明显变化。辣椒素组大鼠MAP由10.74±0.13升至12.8±0.21 kPa (P＜0.001); HR由374±4增至395±5 bpm(P＜0.001)。钌红-辣椒素组大鼠MAP由10.57±0.11升至11.78±0.26 kPa (P＜0.01); HR由 373±3 升至 383±2 bpm (P＜0.05); 钌红-辣椒素组血压和心率的变化与辣椒素组相比有显著差异 (P＜0.05)。

2.颈动脉注射辣椒素所致Fos蛋白在脑干中的表达

FLI阳性反应表现为细胞核内有深褐色颗粒, 呈圆形或卵圆形, 典型的可见核仁空泡区, 胞浆和突起均无显色。在空白对照组, 脑干心血管活动相关核团中有少数FLI阳性颗粒。FLI细胞数在RVLM区的巨细胞旁外侧核(PGL)为10.5±0.5个/切片, 中缝核群 (RN)18.0±0.94个/切片, 中脑中央灰质(PAG) 26.1±1.4个/切片, 蓝斑(LC)8.7±0.7个/切片, 孤束核(NTS) 28.6±1.3个/切片, 最后区(AP) 47.6±1.3个/切片。溶剂对照组中FLI细胞计数较空白对照组的略有增加,但无统计学意义(P＞0.05) 。

与溶剂对照组相比,辣椒素组动物 PGL、 LC、 NTS和AP内的Fos蛋白表达显著增加, 分别增至36.1±1.7, 59.7±1.2,87.4±2.4, 131.8±4.8 个/切片 (P均＜0.001); 而PAG和RN的FLI神经元分别为27.9±1.3, 19.3±1.1个/切片,与溶剂对照组相比均无明显差异（P＞0.05)。

3.钌红对辣椒素诱发脑干核团c-fos 表达的阻抑作用

预先注射钌红后再注射辣椒素, 使PGL、 LC、 NTS、 AP 的Fos蛋白表达明显减少, 与辣椒素组相比FLI神经元分别减少至 18.9±0.9,32.1±1.4, 50.6±2.7, 88.4±2.4 个/切片(P均＜0.001), 与溶剂对照组相比仍有显著差异(P＜0.01); 而PAG、 RN的FLI神经元无明显变化(P＞0.05)。

本实验通过免疫组织化学Fos诱导显示法发现, 颈总动脉注射辣椒素可诱导脑干中PGL、 LC、 NTS、 AP等多个部位的Fos蛋白大量表达,此效应在预先应用辣椒素受体阻断剂RR后明显减弱,而PAG和RN的蛋白表达无明显变化, 由此表明PGL、 LC、 NTS、 aP等这些部位的神经元均可被颈动脉注射辣椒素所兴奋。RVLM是维持和调节血压的关键脑区, 该区含有交感兴奋神经元。我们实验室的前一研究发现,颈总动脉注射辣椒素可引起RVLM区的PGL神经元放电频率增高［4］。本研究结果则从形态学上进一步证实辣椒素可通过激活香草酸受体(辣椒素受体, vanilloid receptor, VR), 进而兴奋RVLM内交感兴奋神经元。

辣椒素是通过特异地激活VR, 继而开放非选择性阳离子通道而发挥作用, CPZ和RR是VR的阻断剂［8,9］。许多资料表明, VR存在于感觉神经元胞体及外周突和中枢突。新近的放射自显影研究显示, VR见于脑干的多个核团, 如TNC、 NTS、 AP 等［10］。Jancso和Such［11］观察到,有辣椒素敏感的神经末梢终止于延髓腹外侧的化学敏感区。Seller等将辣椒素微量注射于RVLM区, 引起血压升高和心率加快, 也支持RVLM区存在VR［2］。 hajos等报道, 辣椒素可激活LC神经元, 并促进它们利用葡萄糖［12］。综合上述资料及本实验结果似可认为, 辣椒素可直接作用于PGL、 LC、 NTS和AP神经元的辣椒素受体,继而使之激活, 引起这些核团神经元Fos蛋白表达增加。然而, 脑干内有多个中枢核团参与心血管活动的调控, 其中PAG、 LC、 AP、 RN和NTS均有神经纤维投射到RVLM区, nTS和AP之间也有相互的纤维联系。因此, 本实验尚不能排除核团之间相互影响的间接作用引起神经元Fos蛋白表达发生变化。至于Fos蛋白表达改变的神经元的性质,还有待于进一步研究。

多种因素可诱导中枢神经元内Fos蛋白的迅速一过性表达, 如电刺激、 外科刺激、 生理和药理的刺激等。电刺激大鼠减压神经增加压力感受器传人活动后, 延髓的NTS、 aP和腹外侧区Fos蛋白表达增强［13］。我们的实验是在切断双侧缓冲神经的条件下进行的,因此得以排除动脉压力感受器活动的影响。本实验观察到的血压升高和心率加快, 是辣椒素激活脑干内心血管活动相关核团神经元所致, 而血压变化不影响核团内神经元Fos蛋白的表达［14］。值得指出的是,溶剂或钌红对照组与空白对照组相比, fLI神经元虽有轻度增加, 但无统计学意义,由此说明我们在实验中观察到的中枢部位Fos蛋白表达明显增强是辣椒素诱发,而非麻醉或手术操作所致。

综上所述, 本研究用免疫组化技术, 从形态学上证明了辣椒素可通过激活VR而直接和/或间接兴奋脑干中的PGL、 LC、 NTS 和AP 的神经元, 而对PAG和RN则无影响。

corresponding author. Tel: 86-311-604-4121,ext.5566. E-mail: syho@sjz.col.com.cn薛保健(河北医科大学基础医学研究所生理室)

何瑞荣(河北医科大学基础医学研究所生理室)

张小雪(解剖教研室, 石家庄 050017)

石葛明(解剖教研室, 石家庄 050017)

参考文献

［1］Quest JA, Dias-Souza J, Norman WP et al. Central nervous system site of action of capsaicin-induced cardiovascular changes in the cat. J Pharmacol Exp ther, 1984, 228: 719～724.

［2］Seller H, Czachurski<