摘要：用噻唑蓝比色法(MTT法)、H3-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)掺入法和流式细胞术, 观察红细胞生成素(EPO)3’端增强子片段对培养的猪肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的内皮依赖性和非内皮依赖性低氧性增殖的影响。结果为:(1)低氧24 h后PASMCs明显增殖, 转入野生型EPO3’端增强子片段可被抑制, 而转入突变型片段无此作用; (2)肺动脉内皮细胞(PAECs)低氧24 h, 其条件培养液有明显的促PASMCs增殖作用, 将野生型EPO3’端增强子片段先转入PAECs, 此作用明显减弱, 而转入突变型片段则无明显影响。提示:(1)PAECs低氧条件培养液可促进PASMCs增殖, PASMCs也可直接感受低氧而增殖, PAECs和PASMCs的低氧反应均被外源性EPO3’增强子片段抑制;(2)由于EPO3’增强子上有低氧诱导因子-1(HIF-1)结合位点, PAEC和PASMC低氧反应可能是通过HIF-1低氧信号转导的共同通路。低氧性肺血管收缩和重建是低氧性肺动脉高压症的两个主要病理变化[1]。肺血管重建包括肌型动脉中膜平滑肌增殖肥大、非肌型动脉肌化、内膜增厚以及外膜成纤维细胞增殖。其中平滑肌增殖为主要作用, 伴有细胞外基质合成的增加。平滑肌增殖可直接由低氧引起, 也可由许多体液因子尤其是内皮细胞释放的一些生长因子引起[2]。红细胞生成素(erythropoietin, EPO)基因是一种典型的低氧反应基因[3], 其mRNA及蛋白水平在低氧时均有明显的增加, 可促进红细胞增殖, 增强携氧能力, 是低氧时机体的一种重要代偿机制。EPO基因的增强子位于3’端, 其核心部分是低氧诱导因子-1 (HIF-1)结合位点, 如低氧诱导的一种调节性转录因子HIF-1与其结合, 可启动EPO基因的转录[3]。目前发现除EPO基因外, 许多非产EPO细胞中的低氧反应基因中均存在与EPO3’端增强子相似的序列, 可与HIF-1结合, 说明HIF-1与EPO3’端增强子相似序列的结合是很多细胞对低氧反应的一个共同通路。对EPO3’端增强子的研究多集中于肝肾细胞、肝细胞癌细胞株Hep3B、HepG2以及HeLa细胞等。本文旨在研究内皮依赖性和非内皮依赖性低氧性平滑肌增殖反应是否也存在此共同通路, 即肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells, PAECs) 和猪肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs) 是否存在共同的低氧信号转导通路。

１材料和方法

1.1主要试剂及仪器 M199培养基干粉、 无血清培养基(Opt1-MEM1）、 Lipofectin (GIBCO公司), 胰蛋白酶粉剂(DIFCO公司), 小牛血清(上海浦东开发区兽医站), CO2培养箱(NUARE, 美国), 酶联免疫检测仪(DG3022A型, 国营华东电子管厂), β-液体闪烁计数器(FJ-2107G型), 流式细胞仪(FAC Scalibur型, Becton Dickinson公司)。

1.2细胞培养

1.2.1肺动脉内皮细胞的分离和培养 健康成年猪, 于无菌条件下取下肺动脉主干, 加以37℃预温的0.25%胰蛋白酶液于管腔中, 于37℃孵育10～15 min; 然后吸出胰蛋白酶液, 加入含20%小牛血清的M199培养液反复冲洗, 收集胰蛋白酶液及冲洗液, 离心去上清;再加入培养液悬浮细胞, 接种于培养瓶中。取第2～4代生长良好的细胞进行实验。

1.2.2肺动脉平滑肌细胞的分离和培养 按汪浩川等所建立的方法[4]培养肺动脉主干平滑肌细胞。 选第2～4代生长良好的细胞进行实验。

1.2.3细胞周期同步化方法细胞生长达50%融合后, 加入无血清培养基Opt1-MEM1, 在37℃培养箱中放置24 h, 使细胞周期同步化。

1.2.4内皮细胞条件培养液的制备 选第2～4代生长良好的PAECs, 达70%融合时, 取相同数目的细胞接种于100 ml培养瓶中。加入等量无血清培养基, 根据实验需要进行不同的处理后, 分别收集培养上清。

1.3EPO3’端增强子片段的合成 由上海生工生物工程公司用美国PE公司的391型DNA自动合成仪合成, DNA序列组成如下:

W18(野生型片段):

5’-agcttGCCCTACGTGCTGTCTCAg-3’

3’-aCGGGATGCACGACAGAGTcttaa-5’

M18(突变型片段):

5’-agcttGCCCTAAAAGCTGTCTCAg-3’

3’-aCGGGATTTTCGACAGAGTcttaa-5’

1.4脂质体转染法[5] 取无血清培养基MEM 1 ml, 配A液: MEM 94 μl+DNA 6 μl(1 μg/μl); 配B液: MEM 95 μl+Lipofectin 5 μl。 合并AB液。室温放置15 min 后, 加800 μl MEM 入Lipofectin-DNA液中, 分别小心滴加于９６孔板的培养细胞中, 每孔100 μl, 继续培养。12 h后, 去除Lipofectin-DNA液, 加新鲜培养液。100 ml培养瓶的Lipofectin-DNA液配制同前, 每瓶加3 ml Lipofectin-DNA液。

1.5复制细胞低氧方法 细胞在5% O2、5% CO2和90% N2下培养24 h, 造成低氧。5%氧的配制采用循环通入N2 44 s、CO2 5 s、空气15 s的方法。2 h后培养箱中氧浓度可达5%, 培养液与低氧气体充分饱和, 氧浓度亦可达５％。

1.6实验分组 实验分两个部分, 第一部分为EPO3’端增强子片段对猪肺动脉平滑肌细胞直接低氧所致增殖的影响, 第二部分为EPO3’端增强子片段对肺动脉内皮细胞低氧条件培养液致肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。第一部分分组: (1)野生型组(W组): 脂质体转染法将野生型EPO3’端增强子片段(W18)转入PASMCs, 低氧培养24h, 检测其增殖状况; (2)突变型组(M组): 转入突变型EPO3’端增强子片段(M18), 其余步骤同W组; (3)低氧组(H组): 不转入DNA片段, 其余步骤同W、M组; (4)常氧组(N组): 不转染, 不低氧, 常氧培养24 h。 第二部分分组: 根据PAECs是否转入EPO3’端增强子片段及低氧同上分为W、M、H、N组, 取各组用条件培养液常氧培养的PASMCs, 检测PASMCs的增殖状况。

1.7MTT法检测PASMCs的增殖状况 采用黄瑾等改良的MTT法[6]检测PASMCs的增殖状况, 酶联免疫检测仪570nm波长比色, 记录OD值。

1.8H3-TdR掺入法检测PASMCs增殖状况 将PASMCs接种于96孔细胞培养板中, 1.5～2×104/孔, 细胞达50%融合时同步化24 h, 按上述4组给予不同的处理。结束实验前6h, 将H3-TdR加入培养板中, 每孔3.7×104Bq。继续培养6h后, 去培养基, 用PBS洗, 1 mol/L NaOH破细胞膜, 加入闪烁液及适量反淬灭剂, 用β-液体闪烁计数器测量, 记录cpm值(每分钟计数)。

1.9流式细胞术检测PASMCs的细胞周期 采用冯剑波介绍的流式细胞光度术[7], 流式细胞仪检测, 结果用百分比表示, χ2检验。

1.10数据处理 结果以x±sx表示, 用方差分析, 并进行多样本均数的两两比较(Ｑ检验), 以P＜0.05作为具有显著性差异。

2结果

２.１PASMCs低氧性增殖及EPO3’端增强子的影响

用MTT法检测显示, 低氧组(H组)OD值明显高于N组(P＜0.01), 转入野生型EPO3’端增强子W18组(W组)的OD值明显低于H组(P＜0.01), 转入突变型EPO3’端增强子M18组(M组)的OD值与H组无明显差异(P＞0.05)。H3-TdR掺入法结果显示, H组之cpm值较N组明显升高(P＜ 0.01), W组明显低于H组与M组(P＜0.05), 但仍高于N组(P＜0.05)。结果表明, 低氧使PASMCs 明显增殖, 而转入野生型EPO3’端增强子片段后, 可抑制或部分抑制低氧增殖反应, 转入突变型片段则无此作用。

2.2低氧PAECs条件培养液促PASMCs增殖作用及EPO3’端增强子片段的影响

2.2.1H3-TdR掺入法结果用PAECs的低氧条件培养液在常氧下培养PASMCs组(H组), 其cpm值明显高于N组(P＜0.05), 用转入野生型EPO3’端增强子W18的 PAECs低氧条件培养液培养PASMCs组(W组), 其cpm值明显低于H组(P＜0.05); 而用转入M18的PAECs低氧条件培养液培养PASMC组(M组), cpm值与H组无明显差异(P＞0.05)。

2.2.2流式细胞术检测结果H组的G0/G1期(静止期)细胞所占比例最小, 而S+G2/M期细胞在各组中比例最大。χ2检验表明, H组G0/G1期细胞数明显低于其它3组(P＜0.05), M组明显低于W组和N组(P＜0.05), W组与N组无明显差异(P＞0.90), S+G2/M期细胞数则与之相反, H、M组明显高于N、W组。

3讨论

低氧可引起机体发生许多反应, 以维持机体氧平衡和对低氧的适应。Maxwell等用EPO基因的增强子中的低氧反应元件构建报道基因, 在许多类型细胞中均发现此转入的报道基因可被低氧诱导, 提示存在一个共同的氧感受和低氧信号转导机制, 其中HIF-1极为重要, 起转录因子的作用[8]。 EPO3’端增强子片段即EPO基因上含有HIF-1结合位点的序列, 其核心序列为5’-CGTG-3’。HIF-1与其结合后, 可作用于启动子而诱导基因表达。

肺动脉平滑肌细胞的低氧性增殖受肺动脉内皮细胞的旁分泌作用调控。 低氧时PAECs分泌的PDGF-A、PDGF-B、ET-1、VEGF及其受体KDR/Flk和Flt、COX-2、TXS、iNOS等增加, 而抑制生长的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)减少, 其中的PDGF、ET-1等均是促PASMCs增殖的强有丝分裂原, 对肺血管重建起重要作用[3]。本实验亦证明了PAEC低氧条件培养液的促PASMC增殖作用。本室从1995年就开始研究EPO3’端增强子对不同的血管内皮细胞的低氧反应调控, 包括原代培养的鼠主动脉内皮细胞和肺微血管内皮细胞以及人脐静脉内皮细胞株, 发现EPO3’端增强子可明显影响这些细胞的一些低氧反应基因的mRNA表达, 如COX-2、VEGF、TXS[9～11]以及ET-1等。我们还用人脐静脉内皮细胞株进行了研究, 也发现低氧诱导的HIF-1的DNA结合活性（待发表）。说明EPO3’端增强子可调整血管内皮细胞的低氧反应。而本实验将野生型EPO3’端增<