摘要：应用膜片箝技术记录游离豚鼠心肌细胞钠通道电流,细胞内微电极技术记录心室乳头肌的动作电位和心电图机记录豚鼠的心电图。使用与心肌细胞钠通道有高度亲和力的海葵毒素(sea anemone toxin, ATXⅡ)改变钠通道开放的动力过程,从三个水平来研究钠通道、动作电位、心电图变化的关系, 并试图探讨长QT综合征(long QT syndrome, LQTs)的发病机制。结果显示: ATXⅡ使钠通道的开放频率增加,钠通道中“长时间开放模式”的开放时间常数增大, 动作电位的持续时间APD50和APD90也分别增加了23%和27%。 ATXⅡ使动物心电图QT间期延长18.6%, qTc (校正的QT间期)增大18.9%。 这些结果提示, 钠通道动力过程的变化对动作电位和心电图QT间期有重要影响,钠通道功能或结构的变异可能是临床上部分长QT综合征产生的原因。长QT综合征(long QT syndrome, LQTs)是一种先天性心脏病, 它主要是由钾或钠通道基因变异所引起[1~5]。在关于LQTs的实验性研究中,还未见在同一种动物上, 从单通道、动作电位(细胞)和心电图(整体)三个水平来研究它们之间的变化关系。国内对LQTs的实验性研究也未见报道。2期李慈珍等:海葵毒素对心肌钠通道开放模式、动作电位及心电图QT间期的影响生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷海葵毒素(ATXⅡ)能特异性地与电压依赖性钠通道结合[6],改变钠通道的动力过程[7~11], 因此, 它常被当作工具药物应用于钠通道的研究中。

我们在细胞单通道研究中曾报道豚鼠心室肌细胞晚钠电流通道有四种开放模式: 短暂开放、散在开放、长时间开放和爆发型开放[12]。在此基础上, 我们应用ATXⅡ来改变豚鼠心肌细胞钠通道开放的动力过程,结合心室肌细胞动作电位和动物整体心电图记录, 研究钠通道开放模式及电流变化对动作电位平台期和心电图QT间期的影响,以试图探讨临床上部分“长QT综合征”的电生理变化机制。

１材料和方法

1.1 豚鼠心室肌细胞的分离豚鼠重250~300 g, 雌雄不拘。致昏后快速开胸, 取出心脏, 放在无钙台氏液中, 按Langendorff方法,用37℃恒压的无钙台氏液和含胶原酶台氏液相继灌流心脏的冠脉系统。随后在室温下用无钙台氏液浸泡心脏, 在台氏液中通以100% O2。2 h后将心室剪成细小块状,用改良的K-B液清洗, 在室温下浸泡1 h后取游离的单个细胞进行实验[13]。

1.2 膜片箝电流的记录把分离的心室肌细胞置于容积为1 ml的标本槽内, 用通氧的台氏液灌流(mmol/L: NaCl 137; MgCl2 1.0; KCl4.6; CaCl2 1.8; 葡萄糖10; HEPES 5.0; pH 7.4)。灌流速度为2 ml/min。用连细胞的膜片箝(cell-attached recording)测定单通道电流。电极液为(mmol/L): NaCl 180, KCl 1.3, MgCl2 0.5, CaCl2 1.5, 葡萄糖5.0, CoCl2 3.0, TEA 10, 4-AP 10, CsCl 10, HEPES 5.0。由于其含有Co2+、 TEA、 4-AP和Cs+,用此可以阻断主要的钙、钾通道, 使在除极箝制过程中记录到的内向离子流仅为钠离子流。观察ATXⅡ的作用时, 在电极液中加入ATXⅡ(Calbiochen, uSA), 使其浓度为2×10－7 mol/L。记录信号经放大器(Axpatch-2D)用Axon公司的SCOPE软件采样,输入计算机储存。同时在数字式存储示波器(DSS6521, KIKUSUI)上监视。实验数据采用分析统计软件Origin5.0进行处理、作图及拟合时间常数。开放频率(occurrence frequency)是指在连细胞膜片箝的斑片膜中,单个钠通道在相同的维持电位(Eh)和测试电位(Ec)下, 每1?000次除极箝制中出现的开放次数。

1．3 豚鼠乳头肌标本制备及动作电位的记录豚鼠重250~300 g, 雌雄不拘, 致昏后, 开胸取出心脏, 放在35℃台氏液中(mmol/L: NaCl137; NaHCO3 23; MgCl2 0.5; KCl 5.4; CaCl2 1.8; NaHPO4 0.4; 葡萄糖10, pH 7.4),恒温下分离右心室乳头肌标本, 并将其置于肌槽内, 槽内温度为34±0.5℃, 用充以95%O2 +5% CO2混合气体的台氏液灌流, pH 7.4,灌流速度为5 ml/min。标本稳定30 min后, 用刺激器(SEN7103, Nihon Kohden)方波刺激, 刺激强度为1.5倍阈值, 波宽1 ms,刺激频率1 Hz。刺激30 min, 乳头肌收缩幅度减小后开始记录动作电位。玻璃微电极内充3.0 mol/L氯化钾, 电极电阻为15~20 MΩ。通过微电极放大器(MEZ8201, nihon Kohden), 经A-D转换输入计算机, 用MCAP软件(上海医科大学生理教研室提供)记录和储存。运用ATXⅡ时, 灌流台氏液中ATXⅡ的浓度为1×10－7 mol/L。

1．4 豚鼠心电图的记录豚鼠重400~500 g, 雌雄不拘, 用20%的乌拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后, 将豚鼠仰卧位固定,用针形电极插入豚鼠的四肢皮下。用心电图机(ECG 6353, Nihon Kohden)记录豚鼠Ⅱ导联心电图。经小隐静脉注射ATXⅡ 1.5 μg/kg,分别记录注射ATXⅡ前后10、20、30、40、60 min的心电图。测量心电图的RR间期、QT间期并计算校正的QT间期QTc (QTc=QT× rR－1/2), 以减少心率变化对QT间期测定的影响。

1．5 数据处理数据资料均采用Oringin统计软件处理, 以Mean±SE表示。显著性检验采用t检验, Ｐ＜0.05为有显著性差异。

2结果

2．1 ATXⅡ对游离心肌细胞单通道的作用

在游离心肌细胞膜片箝实验中, 先将膜电位固定在-120 mV的维持电位(Eh), 然后除极到-50 mV的测试电位(Ec), 箝制700 ms后,回复到Eh。在同一测试电位的数千次除极箝制下, 观察心肌细胞钠通道的开放模式和各种模式出现的频率。在测试组, 电极液内加入ATXⅡ, 使其浓度为2×10－7 mol/L, 在同一Eh和Ec条件下, 比较经ATXⅡ处理后钠通道动力过程的变化。

2.1.1钠通道开放时间的延长在对照和用药组各6例实验中, ATXⅡ使钠通道的开放时间明显延长, 图1为其中一例。在对照组中, 钠通道除了在除极初期开放外,有时亦在长时间的箝制过程中显示出短暂开放和散在开放。但ATXⅡ作用后, 开放时间明显延长。对照组细胞71次和用药组细胞52次箝制叠加平均后的电流曲线。结果显示,对照组细胞的平均内向电流主要集中在除极箝制后的30 ms内; 而ATXⅡ组, 在700 ms的箝制过程中, 除了箝制初期与对照相似有较大的内向电流外,全程均有内向电流通过, 表明通道的开放时间延长。

2.1.2钠通道各模式开放频率的变化在运用ATXⅡ后, 晚钠通道四种模式的开放频率亦发生改变。加入ATXⅡ后长时间开放模式(long opening)的开放频率由对照组的0.54‰ 增加到91.43‰(Ｐ＜0.01)。散在型开放模式(drizzle opening)的开放频率则由18.64‰下降到6.37‰, 爆发型开放模式(burst opening)的开放频率略有增加, 由0.42‰增加到0.57‰。而短暂开放模式(isolated brief opening)基本不变, 分别为7.27‰和7.02‰。

2.1.3 钠通道四种模式开放时间常数(τ0)的变化与对照组相比, 当ATXⅡ作用于细胞钠通道后,钠通道的开放时间常数随着开放频率的改变也相应发生变化。对晚钠通道的四种模式, 我们分别测定了对照组与ATXⅡ作用后开放时间常数的变化(n=6)。

除长时间开放模式外, 其余各种模式, 其开放时间常数无显著性变化, 它们的P值均大于0.05。而长时间开放模式, 其开放时间常数从对照组的1.08 ms增大到18.18 ms。经t检验分析, Ｐ＜0.01, 具有显著的统计意义。图2是其中一例的对照组和ATXⅡ作用后钠通道开放时间的直方图及拟合曲线所得到的相应时间常数。

2．2 ATXⅡ对心肌细胞动作电位的影响

豚鼠乳头肌细胞动作电位记录中, 在灌流液内加入浓度为1×10－7 mol/L的ATXⅡ, 约5 min后, ATXⅡ使动作电位的平台期显著延长(APD50延长),同时动作电位的APD90也相应延长。约15 min时其作用可达最大。 APD50从对照的 168.8±17.4 ms 延长到206.9±14.5 ms,增加近23%; APD90则从201.5±17.3 ms延长到255.4±19.4 ms, 增加27%。再用台氏液灌洗, 可使动作电位基本上恢复到原有水平,和APD90分别恢复到188.2±10.8 ms和221.8±11.7 ms 。表3是7例实验中APD50和APD90的分析统计。运用配对t检验可知, 在ATXⅡ作用下,动作电位的时程明显延长, Ｐ＜0.01, 具有显著意义。

2．3 豚鼠心电图的改变

用标准肢体Ⅱ导联连续记录麻醉豚鼠心电图。注射ATXⅡ后约2 min, 心电图QT间期开始出现延长, 此效应能够持续30 min左右。 其后,豚鼠心电图有时出现室性心律异常, 偶尔亦有因心律失常而死亡。

3讨论

aTXⅡ对心肌细胞钠通道有高度特异性的亲和力[15], 有人认为, 钠通道功能域Ⅲ中的S6和功能域Ⅳ中的S1间球链结构的活动可导致钠通道失活, 被称为失活门(h gate)[16]。ATXⅡ在与钠通道蛋白多肽链的结合过程中[15], 改变了h门的动力过程, 使通道开放时间延长[7~11,14]。本实验结果表明, 当运用ATXⅡ后,与正常对照组相比, 钠通道短暂开放、散在开放的开放时间常数无明显变化, 但它们的出现频率降低; 爆发型开放的出现频率略有增加;而长时间开放模式的开放时间常数不但有明显的增加, 且其出现的频率也显著增高。尽管本实验结果中, 短暂和散在开放的出现频率降低,但长时间开放模式出现频率的增加是否是由散在型或短暂开放转变而来, 还需进一步证实。

由此可见, ATXⅡ使钠通道的开放频率增加, 开放时间延长, 增加了除极过程中经通道的内向电流。单个钠通道的电流虽小, 但在一个心肌细胞上有数万个钠通道,钠通道失活过程的延迟, 可改变动作电位的时程。实验结果2.2中, APD50和APD90在ATXⅡ作用后, 分别延长了23%和27%。本实验在整体动物中注射ATXⅡ后, qT间期明显延长。由于我们是在同一种动物上进行实验, 使用同样的ATXⅡ, 根据实验结果2.1和2.2可以推断: 豚鼠注射ATXⅡ后心电图QT间期的延长是由于改