摘要：本文旨在观察血管内放射对冠状动脉球囊扩张术后细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)及c-fos基因表达的影响。实验对猪的左冠状动脉前降支或回旋支行球囊行过度扩张术, 术后即刻通过血管内放射治疗系统对猪冠状动脉损伤局部给予20 Gy的放射剂量,分别在术后3 d 和30 d处死动物, 留取目标血管组织。通过反转录-聚合酶链反应定量检测血管内放射对球囊扩张术后血管组织c-fos mRNA的表达,采用生化方法测定血管组织ERK1/2的活性。结果表明血管内放射治疗明显抑制了球囊扩张术后3 d ERK1/2活性和c-fos mRNA的表达(20.5%, p＜0.01; 47.7%, P＜0.05), 而对球囊扩张术后30 d的ERK1/2活性和c-fos mRNA表达无显著影响。这提示ERK1/2和c-fos可能参与了血管内放射抑制球囊扩张术后早期再狭窄过程。血管内放射(endovascular radiation)抑制冠状动脉内介入治疗后再狭窄是90年代末医学发展的重大进展。目前国外正进行多中心随机的大规模临床实验,以进一步证实这项技术的有效性及副作用。我们和其他作者均发现血管内放射通过抑制早期细胞增殖和晚期血管重塑可抑制再狭窄[2]。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)作为引起细胞增殖肥厚的细胞内信息传递的关键酶[4~7], 是否参与了血管内放射治疗抑制再狭窄的机制, 尚不清楚。

本实验通过小型猪冠状动脉再狭窄动物模型, 观察血管内放射对血管组织ERK1/2 活性及c-fos基因表达, 探讨血管内放射抑制再狭窄的机制。

１材料和方法

1.1 实验动物及分组 小型猪23头, 购自中国农业大学, 体重20~30 kg, 雌雄不限。动物分组: 球囊扩张术后3 d (n=6)、球囊扩张术后30 d(n=5)、血管内放射治疗后3 d (n=6)和血管内放射治疗后30 d (n=6)组。

1.2 实验仪器及材料 Philips DIGNOST 96 数字减影机, 指引导管(7F JL 3.5, Cordis brite tip),球囊导管(3.5×30 mm, Viva SCIMED)。冠状动脉内铱-192(192Ir)放射治疗系统由中国原子能研究院研制:192Ir线源(活度在13~16 GBq)直径为0.5 mm, 长度30 mm, 与0.889 mm导丝(长280cm)连接。

1.3 主要实验试剂 γ-32P-ATP (杜邦公司)。Leupeptin、PMSF、Aprotin、髓磷酯碱性蛋白(MBP)、Na3VO4、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、考马斯亮蓝(CBB)(Sigma公司)。DEPC、琼脂糖、水饱和酚(北方同正公司); RNA酶抑制剂(华美生物工程公司); NTP (Clonetech); AMV-逆转录酶、dOligo[DT]15 、Taq dNA聚合酶均购自Promega公司。根据引物设计原则, 结合文献报道[8], 采用计算机软件辅助设计引物, 北京赛百盛生物工程公司合成。

1.4 放射源的剂量测定 以距放射源中心2 mm处为参考点, 放射治疗剂量为20 Gy, 放射剂量通过理论计算(Monte carlo方法)和实际测量(慢感光胶片)确定[9]。

1.5 冠状动脉球囊扩张术[1~3] 23头小型猪于术前1 d开始每天给予阿司匹林325 mg, 直至被处死。静脉麻醉, 切开右股动脉, 插入7 f的动脉鞘,常规对冠状动脉左前降支和回旋支近中段行过度球囊扩张术。球囊与动脉直径之比为1.3∶1, 扩张3次, 每次30 s, 间隔1 min,压力606~1?414 kPa, 扩张前后行冠状动脉造影, 评价血管通畅性和损伤程度。手术结束时结扎右股动脉。动物饮食为标准实验室饮食, 不含脂和胆固醇。

1.6 球囊扩张术后冠状动脉内放射治疗[1~3] 在球囊过度扩张术后即将4F USCI Probing catheter(作为输源管)置于动物(n=12)的扩张血管段的远端, 然后将带有192Ir放射源的导丝插入4F USCI导管内, 并通过手动或后装治疗机推进,使放射源驻留在目标血管段。照射时间多在10~17 min, 放射剂量为20 Gy。另11头猪接受假源(导丝的粗细及驻留时间同放射治疗动物)。其余操作与猪的冠状动脉球囊扩张术相同。

1.7 血管组织标本的处理方法 在球囊扩张术后3 d (实验组6头, 对照组6头)及30 d (实验组5头, 对照组6头)处死动物, _焖偃〕鲂脑唷Ｗ笮氖也骞?推注生理盐水, 待流出清亮液体后停止。剥离目标血管, 并尽快放入液氮中保存。

1.8 血管组织ERK1/2活性的测定[10]

1.8.1 样本处理 将血管组织悬浮在5倍体积的冰冷的细胞裂解液(50 mmol/L HEPES, pH 7.5, 150 mmol/L NaCI, 10.0 mmol/L Na4P2O2, 2.0 mmol/L Na3VO4, 100 mmol/L NaF, 1.0 mmol/L PMSF, 2.0 mmol/LDTT,100 U/ml Aprotin, 20.0 μmol/L Leupeptin, 1.0% (V/V) Triton-X-100)中匀浆, 速度在12?000 r/min, 3次, 每次5 s。然后在4℃ 10?000g下离心10 min, 取上清液用考马斯亮蓝测定蛋白浓度(以BSA作标准)。

1.8.2 ERK1/2活性测定 将上清液以CBB法测定蛋白含量后, 取0.3 ml上清液加入0.1 ml激酶缓冲液(HEPES 20.0, pH 7.2, mgCl2 10.0, MnCI2 2.0, DTT 2.0, Na3V04 0.5, EGTA 1.0, 0.1 mg/ml BSA, 蛋白激酶A抑制剂2.0, 50 μmol/L ATP-Na2, 37.0 kBq[γ-32P]ATP, 1.0 mg/ml MBP), 于30℃反应15 min(此条件下为直线反应), 冰浴终止反应。取80 μl反应液点于P81 phosphocellulose滤纸(Whatman),晾干后以0.5%磷酸液冲洗6次, 烘干后置于闪烁瓶中, 加闪烁液静息过夜。以β液闪仪测定MBP中32P掺入量, 同时作空白对照检测,以实验管与空白管的差值表示ERK1/2活性(换算为cpm/min·mg pr)。

1.9 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因表达[8] 采用异硫氰酸胍一步法提取目标血管组织总RNA, 紫外分光光度计定量, 取1 μg rNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。以Cyclophilla为内对照基因扩增c-fos基因。所用引物序列如下: Cyclophilla(369 bp): 5′TAA cCC CAC CGT CTT CTT 3′,5′TGC CAT CCA ACC ACT CAG 3′; c-fos(132 bp): 5′-AGA CCT aGG GAG GAC CTT A-3′, 5′-TGT TAT GTG TGA GGT ACG CA-3′。PCR反应体系为25 μl, 反应条件:95℃变性5 min后, 按94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 90 s, 扩增30个循环, 最后72℃延伸10 min。取PCR反应产物10 μl在1.5％琼脂糖凝胶中电泳,用pBR322/HinfⅠ做分子量标准来判断PCR产物片断大小, EB染色, 紫外灯下观察并照相。底片在密度扫描仪上定量,以目的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达量。

1.10 统计方法 所有数据均用x±s表示, 用单因素方差分析作统计学处理, 以P＜0.05表示具有显著性差异, P＜0.01表示具有极显著性差异。

2结果

２.１血管内放射对血管组织ERK1/2活性的影响

球囊扩张术后3 d血管组织ERK1/2活性明显高于术后30 d (21.1%, P＜0.01); 与球囊扩张术后3 d比较, 血管内放射治疗后3 d eRK1/2活性明显降低(20.5%, P＜0.01); 与球囊扩张术后30 d比较, 血管内放射治疗后30 d血管组织ERK1/2虽有减低,但差异无统计学意义(9.1%, P＞0.05)。

2.2血管内放射对血管组织c-fos mRNA表达的影响

球囊扩张术后3 d血管组织c-fos mRNA表达明显高于术后30 d (103.0%, P＜0.05)。与球囊扩张术后3 d比较, 血管内放射治疗后3 d c-fos mRNA的表达减少 (47.7%, P＜0.05), 但与放射治疗后30 d c-fos mRNA的表达相比略有减少, 差异无显著性。

3讨论

1994年Wiedermann等[1]通过小型猪冠状动脉再狭窄动物模型, 应用血管内192Ir放射源照射冠状动脉, 结果明显抑制了新生内膜形成。1997年Teirstein等[11]报道冠状动脉内放射治疗能够明显降低6个月再狭窄率。随后Condado等[12]和King等[13]报道血管内放射治疗能明显降低PTCA术后病人再狭窄率。说明血管内放射治疗再狭窄可能具有良好的应用前景。我们和其他作者均发现,血管内放射通过抑制新生内膜的形成和血管重塑而抑制再狭窄[1~3]。但更深入的研究, 如血管内放射是否通过抑制ERK1/2活性而抑制再狭窄, 尚不清楚。

体外实验表明, ERK1/2是各种各样的细胞外刺激信号引起细胞增殖分化的细胞内信息传递的共同通路或交汇点[2], 多种生长因子、细胞因子和一些血管活性物质,均可激活ERK1/2。 活化的ERK1/2通过转位从胞浆进入胞核内, 激活多种早期反应的核内癌基因, 如fos、myc、jun等,它们的表达产物都是转录调节因子, 可启动和促进那些与细胞增殖有关的蛋白质基因的转录和表达, 引起细胞增殖、促进蛋白质和胶原的合成等[4,7]。1997年Pyles等[14]在对猪冠状动脉和颈动脉行球囊血管成形术后发现ERK1/2活性增加。Indolfi等[15]通过体内基因转染的方法抑制ERK1/2的上游激酶活性,结果明显抑制了球囊扩张术后新生内膜的形成。Koyama等[16]发现, 注射抗FGF-2抗体明显抑制动脉球囊损伤后ERK1/2活性和细胞增殖, pD98059(ERK1/2的选择性抑制剂)能降低损伤动脉的ERK1/2活性,同时也能抑制内膜增殖。这些体内实验说明ERK1/2参与了再狭窄过程。因此我们观察了血管内放射对ERK1/2和c-fos基因表达的影响。

我们发现血管内放射治疗后3 d ERK1/2活性显著降低, 但球囊扩张术后30 d放射治疗组及对照组ERK1/2活性却无显著差异。通过RT-PCR方法,我们发现血管内放射治疗抑制了球囊扩张术后3 d c-fos mRNA的表达, 但对球囊扩张术后30 d c-fos mRNA的表达也无显著影响。说明血管内放射在抑制ERK1/2活性的同时伴有c-fos mRNA的表达减少, 提示ERK1/2和c-fos可能参与了血管内放射抑制球囊扩张术后早期再狭窄过程。1997年Hu等[17]发现,球囊损伤后早期血管组织ERK1/2活性升高, 同时伴有c-fos和c-jun 的mRNA的升高; 在损伤后7和14 d内膜的ERK1/2仍然升高,并且内膜高于中膜, 提出ERK1/2活性和两种癌基因表达的增加可能参与了再狭窄过程, 这支持我们的结论。

本实