摘要：从雄性初断乳SD大鼠肝匀浆中提取肝刺激因子(HSS)并加以部分纯化, 观察其促人肝癌细胞增殖活性及对p21ras蛋白表达的影响。结果表明: (1) HSS具有明显的促人肝癌细胞增殖活性,其分子量为14～20 kD; (2) HSS可提高p21ras蛋白表达, 具有时间-效应关系, 并与EGF呈协同作用;(3)HSS调节p21ras蛋白表达具有剂量-效应关系, 且呈现出饱和性。鉴于我们已报道HSS上调EGF受体蛋白和基因表达这一事实, 本实验结果进一步说明, hSS促人肝癌肝细胞增殖与其调节EGF受体介导的信号分子传导过程相关。肝脏具有强大的再生能力。肝再生是在多因素参与下精确有序的调节过程［1～3］。表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素等均具有显著的促进肝细胞增殖的作用。然而,这些生长因子不具有组织特异性,因此仅从这些因子出发难以阐明肝再生调节的分子机制。LaBrecque于1975年首先从初断乳大鼠肝中提取肝再生刺激因子(hepatic regenerative stimulatory substance, HRSS［4］, 后称HSS), 继而研究了HSS的理化特征［5～8］。 HSS可刺激肝细胞DNA合成,促进肝细胞由G1期进入S期［9］; 稳定细胞膜, 减轻CCl4和半乳糖胺对肝细胞的毒性作用［10,11］。体外研究证明, HSS确为人胎肝细胞基因表达产物［12］。尽管人们一直努力将HSS制成纯品［7,13］,但未见成功报道。鉴于HSS能增强EGF促肝细胞增殖活性, 近年来也有人将HSS称之为肝再生增强因子(augmentor of liver regeneration, ALR)［14］。HSS是否与已克隆出的ALR同为一体, 尚不能最终定论。 我们曾报道, HSS促肝细胞增殖活性与EGF受体表达相关［15,16］。为研究HSS对EGF受体介导下游信号传导的调节作用,本实验观察了HSS对人肝癌细胞系BEL-7402 p21ras表达的影响, 以进一步探讨HSS作用的可能机制。

1材料和方法

1.1实验动物［17］雄性初断乳SD大鼠(60～90 g), 节律光照饲养1周(7∶00～19∶00光照, 19∶00～次日7∶00避光), 自由饮食。

1.2HSS的提取及部分纯化［18］将上述SD大鼠于第8日7∶00～9∶00之间断颈处死, 剖腹摘取肝脏, 制备HSS。将HSS浓缩(CT60, 丹麦Heto生产)至2 ml, 经Sephadex-G75(Superfine, 瑞典Pharmacia公司)层析, 流动相为DPBS(pH7.4), 洗脱速度为35 ml/h。以分光光度计(Lamda-Bio, 美国PE公司)测定流分体积的吸光值(OD280), 并以此为横坐标, OD280为纵坐标绘制蛋白的分离色谱图。

1.3蛋白定量［19］蛋白定量采用BCA试剂盒(美国Sigma公司)。BCA(bicinchoninic acid)钠盐是一种稳定的水溶性复合物,可与Cu+高度特异性结合, 产生紫色复合物。该复合物在562 nm处有最大吸光值, 并与蛋白浓度成正比。以BSA为标准品求得标准曲线,进而计算未知蛋白样品的浓度。

1.4HSS活性的体外测定实验采用MTT法［20］判定细胞增殖状况。HSS粗提物经Sephadex G-75层析后,根据其OD280可绘成3个蛋白峰。选用人肝癌细胞株BEL-7402, 以含10%胎牛血清(美国HyClone公司)的DMEM(美国GIBCO/BRL公司)培养,按5×104/ml细胞密度接种于96孔培养板, 每孔含5×103个细胞, 于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞完全贴壁后, 换用无血清培养基DMEM(内含10μg/ml胰岛素)。取自上述蛋白流分体积中第1峰波谷至第3峰波谷, 每隔1管取50μg蛋白加入培养基, 测定其促细胞增殖活性。另设对照BEL-7402细胞,加入等体积的培养基, 但不含HSS。孵育24 h后, 每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml, 北京华美生物工程公司), 继续孵育4 h。之后,吸出孔内培养液, 加入150 μl DMSO, 以酶标仪(Microplate Reader 550, 美国Bio-Rad公司)测定各孔490 nm波长处的吸光值, 以洗脱液流分体积为横坐标, OD490为纵坐标绘制HSS活性曲线。上述所有样品均以三孔重复测定。

1.5HSS分子量的鉴定［21］根据1.4结果, 选取HSS活性洗脱部分(相对于220～230 ml流分体积)冷冻浓缩。分别取待测HSS(100 μg)和低分子量蛋白标准(北京天象人生物工程公司)进行SDS-PAGE和硝酸银染色。

1.6细胞处理BEL-7402细胞按2×105/ml密度接种于Φ100mm的培养皿。细胞完全贴壁后, 弃含血清培养基, 以无Ca2+、 Mg2+ dPBS洗涤3次, 换用无血清培养基(内含胰岛素10 μg/ml, 谷氨酰胺2 mmol/L)培养24 h。设4个实验组: (1)对照组, 不含HSS和EGF;(2) HSS组, 加HSS 50 μg/ml; (3) EGF组, 加EGF 20 ng/ml (rhEGF, 美国Promega公司); (4) hSS+EGF组, 加HSS 50 μg/ml和EGF 20 ng/ml。分别孵育6、 12、 24、 36和48 h后收集细胞并裂解。以Western blot法测定p21ras的表达量。根据实验结果, 选取HSS作用活性最强的时间点, 加入不同浓度的HSS(50、 75、 100、 125、 150 μg/ml)观察其剂量-效应关系。

1.7p21ras蛋白表达的测定取50μg细胞蛋白和5μg预染26.6 kD蛋白标准品(美国Sigma公司), 以15% SDS-PAGE分离,以半干转印仪(Trans-blot SD, 美国Bio-Rad公司)将胶中蛋白转至硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane, nC,美国Bio-Rad公司)。按照Gallagher［22］介绍的方法进行Ras蛋白杂交。简要为: NC膜于4℃、5%脱脂奶粉(安怡高钙脱脂奶粉, 新西兰)TBST溶液中封闭过夜;先后与抗H-Ras单克隆抗体(1∶100, sc-35, 美国Santa Cruz公司)及辣根过氧化物酶标记抗大鼠IgG(1∶1?000, 美国Santa cruz公司)室温下孵育各1h。之后, 将膜充分漂洗, 迅速加入发光试剂(美国Santa Cruz公司)进行发光自显影;曝光于X光片上的自显影信号强度经密度扫描仪(GS-700,美国Bio-Rad公司)扫描并经图像分析软件(Molecular Analysist, 美国Bio-Rad公司)处理,得出相应的光密度值。

2结果

2.1HSS的部分纯化及活性测定

超速离心所得HSS粗制品经Sephadex-G75部分纯化及其成分的活性检测之结果如图1。图1显示, 层析图谱呈现出3个蛋白峰。以MTT法分析此3峰蛋白活性表明,仅第3峰起始处及上升支所对应的蛋白具有促肝癌细胞增殖活性, 而其它流分体积中的蛋白无明显促细胞增殖作用。

2.2HSS分子量的测定

选取上述最具HSS活性的洗脱蛋白100μg(位于fraction volume 220～230 ml处), 进行15% SDS-PAGE,而后进行硝酸银染色。结果显示, 部分纯化后的HSS主要由3条带组成, 其分子量介于14.4～20.1 kD(图2), 部分分离纯化所得HSS分子量大小与文献报道一致［18］。

2.3HSS或/和EGF对p21ras蛋白表达的影响

图3为Western blot杂交图, 可见, 随着HSS或/和EGF作用时间的延长, 肝细胞 p21ras表达逐渐增高。HSS处理组的p21ras表达于36 h达到高峰, 表达量增加18.5%; 而EGF组于24 h达到高峰, 表达量增加约30.8%; HSS 和EGF联合应用组则增加到54.5%,提示EGF与HSS具有协同作用。根据HSS最佳作用点为36 h, 本实验采用不同剂量的HSS处理细胞36 h。Western blot结果表明, 随着HSS浓度的提高, p21ras表达也逐渐增大, 呈现明显的剂量依赖效应。值得提及的是, HSS刺激p21ras表达也表现出饱和效应, 即在HSS浓度升至100 μg/ml以后, p21ras表达不再改变(见图4)。这与我们前文报道的HSS上调EGF受体表达时观察到的HSS饱和浓度相似［16］。

图1.HSS Sephadex G-75蛋白洗脱峰与HSS活性比较

fig.1.Elution profile and activity plot of HSS. The crude product of weanling rat liver cytosol was collected as described in “Materials and Methods” and chromatographied using gel filtration through Sephadex G-75 (superfine). The peak fractions at 280 nm were pooled for activity assay using MTT non-radioactive method. The dotted line (……) indicates the elution fraction of the chromatography and the solid line () indicates the activity of the correspondent elution fraction.

图2.部分纯化后HSS SDS-PAGE分子量的测定

fig.2.SDS-polyacrymide gel electrophoresis of par～tially-purified HSS. The active portion of the elution fractions in Fig.1 was collected and subjected to15% SDS-PAGE using silver staining. Lane 1, the low molecular weight protein standard; lane 2, partially purified HSS. It is indicated that the MW of active hSS was ranged between 14.4 and 20.1 kD.

图3.HSS/EGF对BEL-7402细胞p21ras蛋白表达的影响

fig.3.Regulatory impact of HSS/EGF on p21ras expression in BEL-7402.Hepatoma cells BEL-7402 were incubated in either 50 μg/ml HSS or 20 ng/ml EGF or 50 μg/ml hSS plus 20ng/ml EGF for different exposure times. The cells were harvested and50 μg of total protein from the cell lysate was electrophoresed by 15% SDS-PAGE. immuno-chemiluminescence assay using H-Ras (259) monoclonal antibody was performed. Panel A indicates the Western blot for different time-courses and panel B indicates the scanned optical density (OD) of panel A.

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