摘要：本研究对整体大鼠进行了模拟不同海拔高度(3?000、5?000 m)的低氧预适应,然后观察了急性致死性缺氧对这些大鼠海马脑片诱发群锋电位的影响。结果显示, 经低氧预适应的大鼠其海马脑片在给予急性缺氧后, CA1区缺氧损伤电位(hypoxic injury potential, HIP)出现时间以及突触前排放(presynaptic volley, PV)消失时间均明显延迟; 其中5?000 m预适应组的延迟程度比3?000 m组明显。复氧后, PV的恢复率在3?000 m和5?000 m低氧预适应组均明显高于对照组。本研究结果提示,整体动物的低氧预适应可以增强离体海马脑片神经元的耐缺氧能力。离体研究已充分证明, 低氧预适应可以增强神经元的耐缺氧能力。例如, 预先给海马脑片和培养海马神经元一个亚致死性低氧或/和缺血刺激,可以增强这些神经元对随后的致死性缺氧或/和缺血损伤的耐受力[1~4]。然而,整体动物低氧预适应是否能增强脑神经元本身的耐缺氧能力尚不十分清楚。虽然有报道新生大鼠一次性低氧预适应可以减轻随后严重缺血缺氧所致的脑组织损伤[5,6],但这些研究不能排除其他器官系统的影响因素, 无法证明脑组织损伤的减轻是由于脑细胞本身的耐缺氧能力增强。已知海马是对低氧最为敏感的脑区之一,海马神经元的突触传递功能是判定神经元缺氧损伤和耐缺氧能力的重要指标。通过记录缺氧时海马脑片诱发群锋电位的变化,可以观察海马神经元的损伤情况及突触_莨δ堋Ｎ教终宥锏脱踉な视Χ院Ｂ砩窬谷毖跄芰Φ挠跋? 我们对大鼠进行了阶梯式的低氧预适应(3000、5000 m), 通过记录海马脑片诱发群锋电位变化, 观察了急性缺氧对海马神经元及其突触传递功能的影响。

实验用30只雄性Wistar大鼠(60~80 g), 随机分为A、 B、 C三组, 每组10只。A组为常氧对照组, 未经低氧预适应; b组和C组于低压舱中每日接受模拟海拔3?000 m高度的低氧预适应4 h, 2周后取出10只 (B组) 进行实验; 剩余10只大鼠再进1期 赵彤等:低氧预适应增强大鼠海马神经元的耐缺氧能力生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷行2周相当5?000 m高度的低氧预适应, 每天4 h,预适应结束后进行实验。实验时,分别观察急性致死性缺氧对各组大鼠海马脑片诱发群锋电位的影响。海马脑片制备和群锋电位记录方法与我室以往使用方法相同[7]。在乙醚麻醉下, 将动物断头取脑,立即分离出双侧海马, 放入维持供氧4℃人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中,然后用振动切片机沿海马横轴将其切成10片厚约450 μm脑片。将全部脑片置于31℃ ACSF中, 并不断通入95% O2和5% CO2 混合气, 孵育1.5~2 h待用。实验时, 取出一个脑片置于31℃恒温浴槽的尼龙网上, 通入氧混合气(200 ml/min)和ACSF (2 ml/min) 维持。用直径40 μm绝缘不锈钢丝制成的双极电极进行CA3区Schaffer侧支局部刺激,细胞外记录电极采用玻璃微电极(内充4 mol/L NaCl溶液, 电极阻抗4~10 mΩ)记录CA1区锥体细胞的诱发电位。电信号经微电极放大器放大后,输入示波器监视, 同时经数-模转换后输入计算机进行实时处理, 得出点图显示诱发群锋电位波幅变化。图中每一个点代表每10 s电刺激1次时诱发电位的峰值。实验时选用突触前排放(presynaptic volley, PV)大于2 mV、 结构完整、 层次清楚、活性好的脑片。待诱发电位记录稳定10 min后, 迅速将有氧混合气置换成无氧气体(95% N2+5% CO2)给予脑片急性致死性缺氧, 观察诱发电位PV、PS、HIP的变化,当PV消失时, 立即给予复氧。所得数据用平均值±标准误列出。各实验组之间的显著性差别用t检验分析。

实验结果显示, 电刺激海马脑片CA3区的Schaffer侧支时, 在CA1区可记录到顺向诱发群锋电位(oPS)和PV。当oPS和PV波形持续稳定10 min后,给海马脑片急性致死性缺氧处理, 此时诱发电位出现规律的时相性变化: oPS于缺氧2~3 min后幅度开始降低, 时程增加, 随后逐渐消失,但PV仍然存在。约15~20 min后, 部分脑片出现缺氧损伤电位(HIP), 随后HIP与PV依次消失, 细胞呈现完全电沉寂状态。当PV消失后立即复氧, pV和PS依次恢复。以上为在缺氧和复氧后海马脑片诱发群锋电位发生的典型变化。

经比较对照组和不同高度低氧预适应组的结果可见, 对照组的PV自缺氧开始至完全消失的平均消失时间为30.00±3.25 min。经3?000 m和5?000 m阶梯式低氧预适应的大鼠海马脑片, PV平均消失时间则分别延长到35.32±2.94和40.42±4.07 min。此外,复氧后PV的恢复率在低氧预适应大鼠海马脑片与对照大鼠也有不同。如表1所示, 对照组PV的平均恢复率为70%, 而3?000 m、5?000 m低氧预适应组PV的平均恢复率则分别提高到76%、86%。与对照组相比较, 各低氧预适应组的HIP出现时间明显延迟。而且, 随低氧预适应的海拔高度升高, hIP的出现时间也越后延。统计结果表明, HIP的平均出现时间在对照组以及3?000、5?000 m低氧预适应组分别为19.38±1.42、23.74±2.09和28.67±3.18 min。PS在缺氧开始到完全消失所需的时间在对照组和不同低氧预适应组没有显著性差异。对照组PS消失时间为4.33±0.28 min, 3?000、5?000 m预适应组分别为4.56±0.30、5.20±2.75 min 。

大鼠海马脑片在受到急性致死性缺氧刺激时, 典型的诱发群锋电位变化是, PS首先消失, 一段时间后出现缺氧损伤电位(HIP), 若继续缺氧,最终HIP和PV相继消失。脑片活性完全丧失。目前认为, PS在缺氧早期的迅速消失与海马组织内源性腺苷大量释放有关[8]。内源性腺苷通过作用其A1受体,阻断突触传递, 从而导致PS消失。由于突触传递的阻断可以减少能量消耗, 是一种保护性机制, 而HIP的出现实质是PS的再现,意味着腺苷大量消耗和腺苷抑制性作用的解除。因此, HIP出现时间延迟提示腺苷抑制作用的持续时间延长, 是神经元耐缺氧能力增强的表现。同时也有文献报道, hIP是缺氧引起突触传递功能由可逆性损伤向不可逆性损伤过渡的标志[9]。此外, 新近的研究表明, pV是反映缺氧时突触传递功能不可逆损伤的一个重要指标[10]。缺氧时, pV消失时间的延迟提示神经元抗缺氧能力的增强[11]。PV从缺氧开始到完全消失所需要的时间以及复氧后PV的恢复率,均是判断神经元耐缺氧能力的重要依据。本研究结果表明, 缺氧预适应大鼠海马脑片在暴露于急性致死性缺氧环境时,其HIP的出现和PV的消失时间以及PV的恢复率均明显大于对照组; 并且, 5?000 m低氧预适应组的HIP的出现和PV的消失时间以及PV的恢复率大于3?000 m组。这些结果提示, 缺氧预适应大鼠海马神经元的耐缺氧能力大于对照大鼠, 当低氧预适应的海拔高度由3?000 m上升到5?000 m时,海马神经元的耐缺氧能力也明显加强。由于本实验是在整体动物低氧预适应后取其海马脑片观察神经元的耐缺氧能力, 排除了机体其他器官因素的影响,因此本研究比较可靠地证明了整体动物低氧预适应可使海马神经元的耐缺氧能力增强。

本实验未能证明, 在缺氧预适应动物与常氧动物之间, 海马脑片PS从缺氧开始到完全消失的时间有何显著性差异。有人认为, PS的消失是神经元对缺氧刺激的适应性反应, pS的迅速消失可以节省神经元的能量消耗, 具有保护意义[８]。 因此, 神经元的耐缺氧能力增强应表现在PS消失速度的加快,而非延缓。低氧预适应未能改变PS的消失时间,提示神经元的耐缺氧能力增强可能源于其它机制。本实验的结果还不能完全回答缺氧预适应增强海马神经元耐缺氧能力的内在机制。离体海马脑片和培养神经元缺氧预适应机制的研究表明,低氧预适应可以诱导一些内源性抗缺氧损伤因素的表达和释放,从而使神经元对随后的严重低氧的耐受力增强[12~14]。这些内源性抗缺氧损伤因素是否为整体动物低氧预适应增强神经元耐缺氧能力的原因,尚需实验验证。在整体水平进行的低氧预适应增强海马神经元耐缺氧能力的机制, 有待于进一步探讨。

参考文献

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［２］Pez Pinz MA, Mumford PL, Rosenthal M. Anoxia preconditioning in hippocampal slices: role of adenosine. Neuroscience, 1996, 75(3): 687～694.

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[８]Wan Q (万勤), Wang FZ (王福庄), Liu ZW (刘振伟) et al. The role of adenosine in the early stage of anoxia of hippocampal slices and its mechanisms. Chin J Appl physiol (中国应用生理学杂志), 1997, 13 (2): 102~105 (Chinese, English abstract).

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