摘要：实验用硝酸还原酶法测定培养新生大鼠心肌细胞亚硝酸盐(NO-2)和硝酸盐(NO-3)总量(NO-2/NO-3), 反映心肌细胞一氧化氮(NO)生成情况,观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)对心肌细胞NO生成的影响及其蛋白激酶C (PKC)在该效应中的作用。结果显示: AngⅡ可减少心肌细胞NO的含量,并具有明显的剂量-效应关系; AngⅡ受体拮抗剂saralasin可明显抑制AngⅡ对NO生成的影响; L-精氨酸 (L-Arg)明显增加心肌细胞NO的浓度,此效应可被一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME所抑制, L-Arg未能消除AngⅡ抑制NO的作用; 用佛波酯(PMA)处理心肌细胞, 其NO的生成明显减少, l-NAME可加强此抑制效应; PKC抑制剂staurosporine (Stau)可明显削弱AngⅡ 抑制心肌细胞NO生成的效应。结果提示: AngⅡ具有抑制心肌细胞NO生成的作用,此作用可能是通过抑制心肌细胞NOS的活性而实现的; AngⅡ受体介导AngⅡ抑制心肌细胞NO生成的作用; 激活PKC可使新生大鼠心肌细胞NO生成减少, NOS参与此抑制效应,新生大鼠心肌细胞NO生成过程的信号转导通路可能与PKC有关; PKC参与AngⅡ 抑制心肌细胞NO的生成。一氧化氮(nitric oxide, NO)是小分子气体, 可在许多细胞与组织合成。合成NO的前体为L-精氨酸(L-arginine, L-Arg),在NO合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化下合成NO。心肌细胞本身含有NOS, 可自身合成NO。Lowenstein等[1]认为, nO可作为细胞信使分子激活鸟苷酸环化酶,在心血管、神经、免疫等系统中起重要的信息传递作用。NO具有扩张冠脉、改善心脏血液供应、缩小心肌梗塞范围、抑制心律失常以及抗自由基损伤、抗血小板粘附和聚集等作用[2]。心脏局部存在着肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)[3], 心脏的RAS在心肌细胞的生长过程中起重要的作用。心肌细胞的RAS和NO合成系统之间相互影响, NO可以通过cGMP依赖的蛋白激酶途径调节L型钙离子流和抑制心肌收缩功能,同时降低耗氧量[4], 而血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)则可以刺激心肌细胞的蛋白合成, 从而加强心肌的收缩功能。研究发现, 在心肌细胞,蛋白激酶C (PKC)可被AngⅡ激活; 在微血管, NOS抑制剂L-NMMA可明显降低佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, pMA)导致的高血管通透性[5], 提示NO对PKC有一定的作用。 最近, 在其他组织中也发现, PKC参与脂多糖诱导的NO释放和iNOS的表达[6]。然而,在心肌细胞中, PKC是否参与AngⅡ抑制NO的生成, 尚未完全清楚。本实验的目的旨在对心肌细胞AngⅡ与NO合成系统之间的关系及其细胞信号转导的途径进行初步探索。

１材料和方法

1.1 心肌细胞培养 1~3 d龄Sprague-Dawley大鼠由中山医科大学实验动物中心提供, 雌雄不拘。在无菌条件下开胸取心脏, 立即置入4℃ d-Hanks液(mmol/L: NaCl 137, KCl 5.4, Na2HPO4 0.37, K2HPO4 0.44, NaHCO34.2)中截取心室肌, 洗净残血, 剪成约1 mm3大小的组织碎块。弃去D-Hanks液加入0.08% 胰蛋白酶液10~15 ml, 于37℃磁力搅拌消化10 min, 吸出上层悬液, 并加入等量含血清培养基, 经中止消化后离心(2?000 r/min, 5min)弃上清。再加入胰蛋白酶消化液消化10 min,如此重复消化6~8次, 分别收集各次细胞悬液, 加入含血清的培养液, 吹散沉淀细胞, 同条件下再次离心。 将各次离心沉淀后的细胞合并, 用10%血清培养液制成细胞悬液, 置于37℃含5% CO2培养箱内。 根据心肌细胞与非心肌细胞贴壁时间的不同, 采用2 h差速贴壁,分别获得心肌成纤维细胞和心肌细胞。心肌细胞按1×106个细胞/ml分种于50ml培养瓶中, 培养的前2天, 在心肌细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, brdu) 0.1 mmol/L, 以抑制非心肌细胞增殖。所有培养的心肌细胞均每2天换液1次。

1.2 心肌细胞亚硝酸盐/硝酸盐(NO-2/NO-3)的测定 心肌细胞于给药前24 h改用无血清的DMEM培养液(胰岛素10 μg/ml, 转铁蛋白10 μg/ml,维生素 C 100 μmol/L, 维生素 B12 1.5 μmol/L, 青霉素100 U/ml, 链霉素100 μg/ml)进行培养。心肌细胞NO含量的测定过程为:将培养液吸干, 用 D-Hanks 液冲洗心肌细胞2次。然后, 将心肌细胞置于恒温水浴箱(80℃, 15 min), 用300~500 μl去离子双蒸水溶解,并用细胞刮匙刮下细胞。每瓶心肌细胞收集于1.5 ml的Eppendorf离心管中, 离心(12?000 g, 10 min, 10℃), 取上清于另一EP管中,加入去离子双蒸水至500 μl, 严格按照试剂盒操作规程测定其NO-2/NO-3。制亚硝酸钠和硝酸钠标准溶液, 作出亚硝酸钠和硝酸钠浓度－546 nm oD值标准曲线。根据此标准曲线求出心肌细胞中亚硝酸钠和硝酸钠浓度, 并计算出NO-2和NO-3总量。

1.3 药品和试剂 采用血管紧张素Ⅱ (Asp-Arg-Vol-Tyr-Lie-His-Pro-Phe, angiotensinⅡ, AngⅡ); PKC激动剂佛波酯(phorbol12-myristate 13-acetate, PMA)用二甲基亚砜(DMSO)溶解, 临用前按1∶1000(V∶V)比例加至无血清培养液; PKC特异性抑制剂staurosporine(Stau),用无水乙醇溶解成10-4 mol/L, 临用时以无血清培养液稀释; NO前体L-Arg; NOS抑制剂NG-硝基左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME); AngⅡ受体拮抗剂[Sar1,Val5,Ala8]-AngiotensinⅡ(Saralasin,Sar)。以上试剂均为Sigma公司产品。NO试剂盒(Nitrite/Nitrate, colorimetric method)为Boehringer Mannheim公司产品。

1.4 统计学处理 所有数据均以x±s表示。组间数据处理采用组间t检验, P＜0.05表示有显著性差异。

2结果

２.１ AngⅡ对心肌细胞NO生成的影响

实验分对照组和AngⅡ 3个剂量组(10-8、10-7、10-6 mol/L)。在无血清培养24 h后分别加入AngⅡ 10-8、10-7、10-6 mol/L, 每隔12 h分别追加1次, 培养72 h后测定每瓶心肌细胞的NO浓度。对照组NO浓度为20.46±4.39 μmol/L(n=5, n为细胞瓶数); AngⅡ 3个剂量组NO含量分别为15.35±4.1 μmol/L (n=5)、10.67±4.81 μmol/L(n=5)、7.28±2.56μmol/L(n=5), 与对照组相比, NO浓度明显减少, 并呈明显的剂量依赖性。

2.2 Sar在AngⅡ对心肌细胞NO生成中的作用

用10-7 mol/L AngⅡ 受体拮抗剂Sar (n=6) 预处理心肌细胞30 min, 可阻断 10-7 mol/L AngⅡ对心肌细胞抑制 NO生成的作用。单独用同样浓度的 Sar (n=4) 预处理, 对心肌细胞 NO 浓度无明显影响。

2.3 L-Arg在AngⅡ抑制心肌细胞NO生成中的作用

在无血清培养液中加入AngⅡ 10-7 mol/L (n=5), 72 h后NO含量为10.67±4.81 μmol/L, 与对照组(20.46±4.39μmol/L, n=5)相比明显减少(P＜0.05)。用NOS抑制剂L-NAME 10－5 mol/L预处理后, 再加NO供体L-Arg 10-4mol/L(n=5), NO浓度为7.18±2.31 μmol/L, 与单纯L-Arg组的NO含量(35.51±18.58 μmol/L, n=5)比较有极显著性差异(P＜0.01)。在培养液中同时加入AngⅡ和L-Arg (n=5), NO浓度为11.48±3.91 μmol/L, 与单纯L-Arg组比较有极显著性差异(P＜0.01),但与单纯AngⅡ组相比无显著性差异(P＞0.05)。

2.4 PKC在NO生成中的作用

2．4．1 PMA的作用 将PMA 10－5 mol/L加入培养的心肌细胞, 以激活心肌细胞的PKC, 30 min后测定其NO含量为9.73±2.05μmol/L (n=6), 与对照组(22.25±5.01 μmol/L, n=5)相比明显降低(P＜0.05)。PMA+L-NAME (10-5 mol/L)组NO含量为6.45±2.85 μmol/L, 与PMA组相比NO含量进一步减少(P＜0.05)。为了进一步探讨PKC是否通过NOS抑制NO生成,我们预先在培养液中加入L-NAME 10-3 mol/L, 以充分抑制NOS, 24 h后再加入PMA 10-5 mol/L (n=5), nO含量为6.88±2.76 μmol/L, 与PMA+L-NAME(10-5 mol/L)组的NO含量相比没有进一步被抑制(P＞0.05)。

2．4．2 Stau的作用 单纯给予PKC抑制剂Stau预处理的心肌细胞, NO浓度为18.48±5.71 μmol/L (n=4),与对照组NO含量(22.25±5.01 μmol/L, n=5)相比无明显差异。但用Stau预处理, 再加入AngⅡ 10-7mol/L, nO含量为24.36±5.88 μmol/L (n=5),明显高于单纯PMA组和单纯AngⅡ组, P值均小于0.01。

3讨论

有证据表明, 心脏局部存在有RAS[3], RAS可能参与自发性高血压大鼠心肌肥厚的发生[7]。国内外大量的研究表明, AngⅡ 可诱导心肌细胞肥大,主要表现为 (1)直接刺激心肌细胞肥大; (2)通过抑制NO生成而使防止心肌细胞肥大的力量减弱。NO是已知最强的内源性血管舒张物质,又是一种新型的细胞信使分子, 可在许多组织(包括心肌组织)内合成, 参与许多疾病过程。在体研究发现, 长期服用L-Arg可减轻自发性高血压大鼠的心肌肥厚[8]。Dubey等也报道,内、外源性NO均可明显抑制 AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞的分裂、增殖和迁移。实验证实, 心肌细胞本身含有NOS[9], 能利用L-Arg生成NO,调节心肌细胞的功能。NO的半衰期极短(约3~5 s), 直接测定极为困难。但是, NO在中性溶液中,快速氧化生成稳定的亚硝酸盐和硝酸盐(NO-2/NO-3)。细胞NO-2和NO-3浓度之和(NO-2/NO-3)可作为NO生成的良好指标。因此,可通过测定心肌细胞NO-2/NO-3来判断NO的水平。我们采用硝酸还原酶法测定细胞中NO-2/NO-3, 以反映心肌细胞NO生成的水平。结果观察到, AngⅡ可减少心肌细胞NO的含量,并具有明显的剂量-效应关系。 此外, 在培养液中加L-Arg可明显增加心肌细胞NO的浓度, 此效应可被NOS抑制剂L-NAME所抑制, L-Arg未能消除AngⅡ对心肌细胞NO生成的抑制作用。以上结果表明, angⅡ 对心肌细胞NO的生成具有明显的剂量依赖性抑制作用, 此作用可能是通过抑制心肌细胞NOS的活性而实现的。我们还观察到, AngⅡ受体拮抗剂saralasin本身对新生大鼠心肌细胞NO含量无明显影响,但可明显抑制AngⅡ对心肌细胞NO生成的作用, 表明AngⅡ抑制心肌细胞NO生成的作用是通过