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在正常生理条件下, 初级感觉传入神经元上存在一些儿茶酚胺能神经纤维的支配。 两者之间没有功能上的耦联［1,2］。 当组织炎症和外周神经损伤后, 感觉神经元和外周感受器对肾上腺素受体激动剂和交感传出纤维兴奋表现异常敏感［3～6］。 在外周神经损伤的实验模型上一些研究已经观察到不同的α-肾上腺素受体介导了交感-感觉耦联作用［3,7,8］, 这种交感-感觉耦联作用的细胞内机制目前还不清楚。 有报道, cAMP-蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)系统参与外周感受器的痛觉过敏和炎症状况下初级感觉神经元的敏化过程［9～11］。 我们的前期工作发现, PKA介导损伤背根节(dorsal root ganglion, DRG)神经元的自发放电［12］。 本实验利用大鼠DRG慢性压迫(chronically compressed DRG, CCD)模型［13］, 在离体灌流DRG, 采用单纤维记录神经元自发放电的方法, 进一步研究损伤DRG神经元的肾上腺素能敏感化作用, 以及内源性cAMP-PKA 系统在其信号转导中的作用。
1材料和方法
1.1动物与手术59只Sprague-Dawley大鼠(200～350 g), 雌雄不拘, 由第四军医大学实验动物中心提供。 其中54只大鼠在戊巴比妥钠(40 mg/kg, ip)麻醉下,进行L4和L5 DRG慢性压迫手术［13］。 5只未行DRG慢性压迫手术的正常大鼠, 作为对照组。
1.2离体DRG标本的制备和DRG神经元单纤维自发放电记录DRG慢性压迫手术后1～10 d的动物和正常大鼠进行背根单纤维自发放电的引导和记录。 戊巴比妥钠(40 mg/kg, ip)麻醉下, 在背部L1～L6处行椎板切除术, 充分暴露两侧L4、L5 DRG, 小心游离损伤L4、L5 DRG及其相连的脊神经约2 cm和L4、L5 后根2 cm。 将带有脊神经和后根的L4、L5 DRG移于95% O2+5% CO2饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中平衡30 min。 实验时, 将一个DRG标本放入特制的灌流槽内, 以ACSF对DRG进行灌流, 流速1～2 ml/min, 温度控制在33±1℃。 在置放脊神经的浴槽内安置一对刺激电极, 连接刺激器, 用以检测神经纤维传导速度。 连接DRG的后根经槽间缝隙放入盛有石蜡油的小槽内。 在实体显微镜下从L4 和L5背根分离出直径约20 μm的神经细束, 将中枢端悬挂在白金丝(直径29 μm)引导电极上记录损伤侧或正常侧DRG单根纤维放电, 该槽内安置参考电极, 槽间缝隙用凡士林隔开。 在这样的神经细束上, 如记录到多个单位的自发放电, 则将细束丝再度分细, 或重新分离其它细束, 直到所观察的细束中仅有一个自发放电单位时, 才开始实验记录。 确定单个单位放电的标准是动作电位的幅度和波形相同。 放电经VC-11示波器显示后, 通过A/D板或动作电位的峰峰间期(Interspike interval, ISI)采样板采集放电信号, 用计算机记录损伤和正常DRG神经元的单纤维自发放电的原始放电图、 ISI序列和放电密度直方图。
1.3药品去甲肾上腺素, 哌唑嗪, 育亨宾, 苯肾上腺素和可乐定为Sigma公司产品, Rp-cAMPS 和SQ22, 536为RBI 公司产品, H-89 为Seikagaku 公司产品。
1.4数据处理放电频率最大增加百分数按下列公式计算：
其中基础频率为加药前3 min放电数的平均频率, 最大反应频率是加药期间放电数增加到达最大值1 min的平均频率。
所有数据均以均数±标准误表示。 采用NOSA软件包的方差分析和SPLM软件包的Wilcoxon符号秩检验进行统计处理(除特殊注明, 以下均为方差分析处理)。
2结果
2.1损伤DRG神经元自发放电的一般特点
在54例慢性压迫损伤的DRG, 离体记录了165条有自发放电的单纤维和15条静息单纤维的放电活动, 它们的传导速度在5.0～47 m/s范围, 属于A类型有髓纤维。 依据锋电位间期(ISI)序列的非线性动力学特征, 损伤DRG神经元自发放电的节律形式可分为以下3类［14］：(1)周期节律, 占10.3% (17/165);(2)非周期节律, 占35.8%(59/165)；(3)阵发节律, 占53.9%(89/165)。
2.2损伤DRG神经元的去甲肾上腺素敏感性
用10 μmol/L 外源性去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)作用损伤DRG 3 min, 在95个有自发放电的损伤DRG神经元上, 85个(89.5%)表现为对NE敏感。 其中, (1) 44个表现为兴奋作用(单纯兴奋), 其中记录完整的32个神经元的放电频率最大增加百分数为(187.40±45.08)%(P＜0.01)；(2) 21个表现为先兴奋后抑制效应, 在兴奋期间的放电频率最大增加百分数为(291.56±72.80)%(P＜0.01), 抑制期间绝大多数情况下呈现无放电状态；(3)6个出现兴奋-抑制交替振荡, 兴奋期间的放电频率最大增加百分数为(420.74±119.98)%(P＜0.05)；(4) 14个出现抑制现象。 总之, NE对慢性压迫损伤DRG神经元作用形式可分为抑制和兴奋作用, 其中兴奋作用包括单纯兴奋、先兴奋后抑制和兴奋-抑制交替振荡3种形式(图1)。 此外, 还观察到15个静息的损伤DRG神经元对NE产生明显重复放电。 上述有自发放电和静息的损伤DRG神经元对无Ca2+-ACSF均可产生明显兴奋效应。 相反, 在5例未受损的DRG中, 5个有自发放电和15个静息的DRG神经元对NE不反应, 而对无Ca2+-ACSF可产生明显兴奋效应。
1有自发放电的损伤DRG神经元对NE的反应形式
Fig.1Response to NE in injured DRG neurons with spontaneous activity
The solid line indicates the duration of application of NE (10 μmol/L). (A) Simple excitation (B) Excitation followed by suppression (C) Alternated excitation and suppression (D) Simple sup～pression. Time scale 50 s, vertical mark Impulses per 2 s: (A) 10; (B, C) 25; (D) 10.
2.3α-肾上腺素受体激动剂和拮抗剂的作用
用α2和α1肾上腺素受体拮抗剂育亨宾(10 μmol/L)和哌唑嗪(5 μmol/L)分别预孵育损伤DRG神经元后［6］, 再观察NE的作用。 结果发现, 育亨宾预孵育前, NE的放电频率最大增加百分数为(152.11±5.77)%, 预孵育10 min后, NE的放电频率最大增加百分数为(68.66±14.50)%, 兴奋作用可以明显被抑制(P＜0.01, n=5 ) (图2)。 此外, 在两个损伤DRG神经元中观察到育亨宾可以减小NE的抑制作用。 育亨宾本身对损伤DRG神经元的自发放电呈现兴奋作用, 其放电频率最大增加百分数为(146.85±28.31)%(P＜0.01, n=10)。 哌唑嗪以相同的步骤预孵育另外的5个损伤DRG神经元10 min, NE的放电频率最大增加百分数由(114.25±27.26)%明显降至(26.99±10.86)%(P＜0.05, n=5)。 哌唑嗪本身对损伤DRG神经元(n=5)的自发放电无明显影响。 为了进一步阐明肾上腺素能敏感化作用的受体机制, 在同样的6个有自发放电的损伤DRG神经元上观察了α1和α2肾上腺素受体选择性激动剂苯肾上腺素(10 μmol/L)和可乐定(10 μmol/L)［3］的作用, 其放电频率最大增加百分数分别为(42.10±9.83)%(Wilcoxon符号秩检验, P＜0.05)和(50.10±4.84)%(P＜0.01)。 还在另外一个损伤DRG神经元上观察到可乐定对自发放电呈现抑制作用。
2α肾上腺素受体拮抗剂对损伤DRG神经元NE兴奋性作用的影响
Fig.2Effects of α adrenoceptor antagonists on the excitatory response of NE on injured DRG neurons
The maximum increase percentage of discharge rate of NE on injured DRG neurons was markedly decreased by yohimbine (10 μmol/L) or prazosin (5 μmol/L) respectively.
2.4Rp-cAMPS阻断NE的兴奋作用
为了分析NE对损伤DRG神经元兴奋性作用的细胞内机制, 在DRG浴槽中加入PKA选择性抑制剂Rp-cAMPS (50～250 μmol/L)［12, 15］。 结果发现, Rp-cAMPS作用 10～15 min 后, NE的放电频率最大增加百分数作用为 (36.52±20.12)% (图3), 而Rp-cAMPS作用前NE的放电频率最大增加百分数作用为(226.03±87.47)%, 两者间有显著性差异(Wilcoxon 符号秩检验, P＜0.05, n=6)。 在Rp-cAMPS明显抑制NE对损伤DRG神经元产生的兴奋时, 加入无钙的ACSF可以产生重复放电。 Rp-cAMPS本身作用5～10 min对损伤DRG神经元的自发放电有明显抑制作用, 冲洗5～20 min可以恢复给药前状态(n=5)。
