摘要：利用消减抑制杂交(SSH)技术分析左眼视网膜摘除后成鸽左右前脑基因差异表达情况, 对14个重组子经反Northern杂交去除假阳性, 最终获得4个阳性重组子, 对阳性重组子进行克隆和测序,其中PFB/SSH-8片段长226 bp, 它的138 bp与人CaM Ⅰ基因外显子有85% 的同源性; PFB/SSH-15片段长252 bp, 与 nexin I alpha非表达序列有低的同源性; 另外2个片段未发现有同源物。对于人类和多种动物而言,视觉是其最重要的感觉系统。在视觉研究中, 视网膜光感受的分子机制已基本得到阐明[1],有关视觉信息处理的脑生理机制方面的研究也取得了长足的进步[2], 但关于 脑中视通路信息传递和加工的分子机制, 迄今尚知之甚少。我们以单眼视网膜摘除鸽为模型,通过消减抑制杂交方法, 分析了单眼视网膜摘除后鸽前脑左右侧基因表达的差异, 为探究哪些基因参与了这一信息传递和加工过程或者有可能参与视传导途径的分子构筑,进行了一些初步的探讨性的工作。

取美洲大白鸽, 孵出后将左眼视网膜摘除, 由母鸽哺育至30 d, 建立左眼视网膜摘除鸽模型。用断头法处死后获取组织, 立即置于冰上; 分别取左右前脑,迅即提取RNA 。RNA 样品制备采用TrizolTM kit (Gibical公司)抽提左右前脑total RNA;继用DNase I消化基因组DNA[3]。 mRNA制备是根据Oligotex mRNA mini kit (Qiagen)说明书操作,然后逆转录合成双链cDNA, 以左右前脑2μg mRNA为模板, 用superscriptTMⅡ酶逆转录成第一链, 进而合成第二链, 方法参考Clontech 公司的PCR-SelectTM cDNA subtraction kit 说明书。SSH差异筛选也参考Clontech 公司的PCR-SelectTM cDNA subtraction kit说明书。用一种识别4碱基的平端限制性内切酶RsaI分别消化两者的ds cDNA 使之均一化; 左前脑为 “tester”; 右前脑2期许蕾等:单眼视网膜摘除后鸽左右前脑基因的差异表达生理学报 Acta Physiol. Sin.53卷为“driver”,两份相同的“tester”分别与接头adaptor 1和adaptor 2R连接, 而“driver”组分不加接头;两份不同的“tester”分别与过量的“driver”cDNA进行第一次杂交, 使差异表达的基因序列以单链cDNA的形式富集; 将上述两种杂交液混合,并加入过量的新鲜变性的driver cDNA进行第二次杂交; 用外引物和内引物分别进行两次PCR扩增; 将第二轮PCR产物经NotI和EagI 双酶切后连接于pBluscript(sk－)载体中, 转化TG1 宿主菌, 根据蓝白筛选挑取白色重组子, 提取重组体质粒用于测序和杂交。质粒提取、纯化采用Qiagen plasmid mini kit(25)。测序通过双脱氧末端终止法在本室LI-COR 4200全自动测序仪上测序, 测序结果输入GenBank, 通过BLAST2.0软件进行同源性分析。反Northern杂交筛选阳性片段(4) 分别取左、右前脑total RNA 20 μg, 第一链合成引物cDNA synthesis primer及superscriptTMⅡ 酶, 通过反转录使之参入α-32P,从而合成同位素标记探针。将重组质粒变性后(变性液终浓度为0.5 mol/L naOH; 1.5 mol/L NaCl)分别点于两张尼龙膜对应位置上, 80℃烤膜2 h固定DNA, 两种探针分别与两张尼龙膜进行杂交,－80℃放射自显影72 h。

结果如下:

1． 消减抑制杂交

经两轮PCR扩增, 产物克隆进pBluescript 载体, 重组子经Pvu Ⅱ酶切鉴定均有插入, 且插入片段大多在200~500 bp之间。

2．反Northern杂交

利用反转录的方法分别以左眼剥夺鸽的左右前脑total RNA为模板合成探针,对初步获得的重组质粒进行反Northern 杂交。于14个插入片段中有4个具明确差异,分别为 b3、c4、d2和d4, 且均为左侧前脑差异表达。

3．阳性重组子测序及同源性比较

对4个经反Northern印迹证实为差异表达的阳性重组子的测序结果与 GenBank中已知序列进行同源性比较表明(截止于1999年11月): PFB/SSH-8片段长226 bp, 其中138 bp与人 CaM Ⅰ基因部分外显子有85%的同源性; PFB/SSH-15片段长252 bp, 与nexin Ⅰ alpha有低的同源性; pFB/SSH-13片段长232 bp; PFB/SSH-28片段长250 bp, 均未发现有同源性信息。上述4个EST片段, 向GenBank申请了基因序列号,它们分别是: User_Id GenBank_Accn EST001 BE202373; EST002 BE202374; EST003 BE202375; eST011 BE202383。其中7个无差异表达的EST片段在GenBank中的accession number如下: EST004 BE202376、 eST005 BE202377、 EST006 BE202378、 EST007 BE202379、EST008 BE202380、EST009 bE202381和 EST010 BE202382。

鸟类具有非常发达的视觉系统, 其视觉通路有两条[5]: 一条是视盖视觉系统, 其投射通路为光线通过视网膜转导为生物电信号后传到对侧视盖,然后从视盖到达同侧和对侧圆核(nucleus rotundus), 再从圆形核投射到同侧的纹状体外侧区域(ectostriatal regeon);另一条通路为丘脑视觉系统, 其投射通路为光线通过视网膜转导后到达对侧丘脑, 特别是位于丘脑背侧的丘脑主视核(OPT),然后从OPT到每侧前脑高位纹状体区域。丘脑通路的投射大多是到同侧高位纹状体, 但对侧纹状体也接受部分的视投射,约为同侧视投射的10%~50%。外界光线刺激的不同及其它因素都可造成视通路发育及信息加工的不对称性。有文献报道[6]正常情况下视觉中继核的上行投射纤维投射到两侧的纤维正常发育;当一只眼被遮蔽时, 其支配的上行纤维在发育中互相竞争, 使遮蔽眼在皮层投射区的发育受抑制、变小、萎缩, 神经细胞动作电位降低;而向心纤维也发生退行性变化。所以当外界光线输入不同时, 除可直接影响视觉中继核外侧膝状体(鸟类为视盖)的发育及功能外, 也影响到脑中枢部位的分子构筑及功能,如此必然涉及到基因表达方面的差异。

我们选择单眼视网膜摘除鸽作为研究的模型是基于以下考虑: 鸽是后成鸟, 即出生后仍由母鸽哺育, 一周后才睁眼; 而且在胚胎发育期, 其身体就弯向左侧,左眼受身体遮盖; 雏鸽孵出后即做单眼视网膜摘除, 使得左眼从胚胎期到成体均未接受光刺激, 从而左右视途径的发育差异较大, 适于做差示研究。另外,又由于鸽的视交叉为完全视交叉, 即左侧视神经完全交叉至右侧视盖, 而右侧视神经完全交叉至左侧视盖。在信息上传至高级中枢时, 虽然视盖上存在着左右前脑功能的整合,也必将引起中枢发育在形态结构及功能上的差异。尽管此模型不能完全排除由损伤引起的基因的差异表达, 但由于实验时是术后一月才进行, 我们认为这种作用是很小的。

eST序列同源性结果为PFB/SSH-8片段与CaM Ⅰ有部分同源性, 但两者之间的关系有待进一步研究。另一片段与nexin I alphaf非表达序列有低的同源性;据报道nexin I alpha与突触退化的抑制作用有关[7],但两者的同源性甚低。4个经反Northern印迹证实为差示表达的EST片段所代表的全基因有待进一步克隆和测序,它们所表达的产物在视觉传递途径中有何意义和作用亦有待未来的工作探讨。另7个EST片段虽然未能显示出在左右前脑中有差异表达,但它们在脑中的表达却是不争的事实。它们是不是在脑中特异表达, 在神经活动中有什么功能和意义,进行深入的研究也许不无意义。我们想对经反Northern初步筛选的有意义的EST片段进行Northern分析, 进一步证实反Northern结果,而且可以了解该基因的长度及它在脑组织不同部位的分布状况等。 我们希望通过RACE方法克隆全长基因, 进一步研究其功能。

在基因差异表达的研究中方法很多, 例如差异显示逆转录-PCR(DDRT-PCR)、RNA fingerprinting by arbitrarily primed polymerase chain reaction(RAP-PCR)等。根据我们的工作经验, SSH的方法较之DDRT-PCR更具优越性;其实验结果假阳性率明显较DD-PCR为低, 这与文献[3]的报道一致, 而且一周左右即可获得一个消减的文库; 更多的实验结果表明, SSH是一简便、快速、高效地获得差异表达基因的方法[8~10]。

参考文献

[1]Wang Y (王 尧). Molecular mechanism on light-transduction in retina. Newslet neurochem(神经生化学通讯), 1999, 12(2):96~107 (Chinese).

[２]寿天德. 视觉信息处理的脑机制. 上海: 上海科技教育出版社, 1998.

[３]Liang P, Averboukh L, Pardee AB. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Nucleic Acids res,1993, 21(14):3269~3275.

[４]Xu L (徐磊), Lu LX (吕立夏), Yang XL (杨秀丽) et al. MPTP induced differentially expressed gene in substantianigra of C57BL mice. Chin J Neuroanat (中国神经解剖学杂志),1999, 15(4):355~357 (Chinese, English abstract).

[５]Rogers L. Behav, Structural and neurochemical asymmetries in the avian brain: a model system for studying visual development and processing. Neurosci Biobehav rev, 1996, 20(3):487~503.

[６]Tadaharu T. Plasticity of developing visual cortex and neurotrophins. protein, Nucleic Acid and Enzyme， 2000, 45(3):483~490.

[７]Ding P(丁沛 ), Xu L(徐磊), Li XL(李学礼) et al. Cloning and identification of eST from vision associated region of rat brain. Acta Shanghai Railway Univ (Med ed)(上海铁道大学学报医学辑)， 1999, 20(9):1~3 (Chinese, English abstract).

[８]Xue QM(薛启冥). Retrospect to the 11th international developmental neuroscience meeting. Chin J Neurosci(中国神经科学杂志), 1998, 14(1): 59~62 (Chinese).

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