摘要：实验以单个Wistar大鼠胰腺β细胞为对象, 用穿孔膜片箝和细胞贴附式记录技术研究ATP敏感K+通道(KATP)、 延迟整流型K+通道(KDR)、 ca2+通道和Na+通道的有关特性。结果表明: (1) KATP通道的内流电导约65 pS, 外流电导约31 pS, 反转电位在－60 mV左右; (2) kDR通道在延迟 20 ms后达到最大激活, KDR电流约为KATP的1/3; (3)钙电流在0 mV左右达到40～60 pA的峰值, l-型钙通道是大鼠β细胞主要的钙通道, 其上还含另一种高电压激活的钙通道; (4)约有一半的β细胞有明显的钠电流, 钠通道在10 mV左右达到200～400 pA的峰电流。糖尿病是危害人类健康的重大疾病之一, 糖尿病的病因可归结为胰腺β细胞胰岛素分泌的绝对或相对不足［1］。胰腺β细胞是一种电兴奋性细胞,其膜上离子通道的活动在刺激-分泌耦联中起了关键作用, 某些离子通道的缺陷是糖尿病的重要发病原因［2,3］。因此, 研究β细胞的膜离子通道特性,既是深入研究其分泌调控机制的基础, 又是揭示糖尿病病理的重要研究内容之一。至今, 有关哺乳动物β细胞膜离子通道的研究成果主要集中在啮齿类动物(小鼠、 大鼠)、犬属动物和人的β细胞上, 尤其以小鼠为多。 资料表明, K+通道和Ca2+通道, 有时还有Na+通道, 是β细胞上最活跃的离子通道,但其种类和特性在不同种属的β细胞上存在明显的差异。其中, 大鼠β细胞因离子通道电流较小,使实验工作更困难而研究较少［4～6］。我室已率先在国内开展了对与胰岛素分泌密切相关的β细胞内钙信号调控机制的研究［7,8］。本文应用穿孔膜片箝技术,研究了单个大鼠胰腺β细胞上几种重要离子通道的特性。

由于这些特性对β细胞电兴奋性和分泌特性有调节作用, 本工作既为阐明β细胞的种属特征提供了资料, 又为今后研究糖尿病模型鼠的离子通道特性,揭示离子通道变异与糖尿病的关系, 做了初步的准备。

1材料和方法

1.1试剂和溶液胶原酶V、 多聚赖氨酸、 河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)、 nifedipine、 HEPES、 TEA-Cl、 tolbutamide、 nystatin为Sigma产品; DispaseⅡ、 RPMI-1640、 胎牛血清、 BSA为Gibco产品;其它试剂为国产分析纯。依文献［9］选择普通电极内液的成分为(mmol/L): 63.7 KCl, 28.35 K2SO4, 11.8 NaCl, 1 mgCl2, 47.2 sucrose, 20 HEPES, KOH校定pH为7.3。在上述普通内液中加入250μg/ml穿孔剂nystatin即得穿孔膜片箝内液。普通细胞外液成分为(mmol/L):129 NaCl, 4.7 KCl,1.2 KH2PO4, 5.0 naHCO3, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4.7 H2O, 10 HEPES, 3 glucose, naOH校定pH为7.4。在此外液中加入0.1% BSA、 100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素, 即得β细胞分离培养用的KRBB生理溶液。

为阻断K+通道配制的TEA外液成分为: 120 NaCl, 20 TEA-Cl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 3 glucose,10 hEPES, pH校定同普通胞外液。

实验前所有溶液用0.2 μm微孔滤膜过滤。实验中根据需要, 将用普通外液配制的各种药物母液(如CdCl2, nifedipine, tolbutamide, tTX等)稀释至所需的终浓度。细胞培养基为添加有10% (体积比)灭活胎牛血清的基本RPMI-1640培养基。

1.2细胞制备及培养原代培养制备单个β细胞的基本方法参见我室发表的前文［8～10］。实验选用培养2～6d、 直径在12～14 μm的细胞。

1.3细胞贴附式与穿孔膜片箝记录研究使用EPC-9型膜片箝放大器(HEKA, Germany)。该放大器由Macintosh Qudra 650(Apple, USA)下运行的Pulse＋pulsefit 8.0软件(HEKA, germany)进行控制。控制接口和数据的采集记录由内置于EPC-9中的ITC-16多功能数据采集卡(Instrutech, USA)完成。

培养48 h后的细胞按一般方法可完成高阻封接, 在此贴附式状态下可进行单通道记录。若将所箝制的膜片吸破则形成了全细胞构型。全细胞记录时有一个难以克服的缺陷:某些通道电流会随时间而衰减(run-down)。Horn等的工作发现,当电极内液中加入一定量的制霉菌素(nystatin)或两性霉素B(amphotericin B)时, 会在已形成贴附式构型的膜片上形成直径约为0.8 nm的孔道, 这种微小直径的孔道既保证了电极和细胞内电学上的导通, 又有效地避免了wash-out作用, 这就是所谓的穿孔膜片箝记录技术［11,12］。然而,早期有两个困难妨碍了穿孔膜片箝的使用。一个困难是穿孔速度太慢, 需经5～30 min才能达到有效箝位;第二个困难是配好的nystatin或amphotericin B溶液只能使用2～3 h, 每次实验前必须配制新鲜溶液。总之,能成功记录电流的难度很大［11～13］。 周专等通过改进nystatin溶液的配制、 贮存和使用方法, 在很大程度上克服了上述困难［9,14］。参考周专等的方法, 本课题在小型超声波清洗器中配制nystatin内液, 在共振状态下混合nystatin母液［5 mg nystatin溶于40μl二甲基亚岚(DMSO)中］, 可使nystatin颗粒分散得非常细小。而在贮存、 配制和使用时保持nystatin溶液处于低温(接近0℃)和避光环境中, nystatin的活性可以保持1周左右。nystatin溶液的终浓度为250 μg/ml。 实验中先用普通内液灌尖10～15 s, nystatin内液则从电极后端充灌。封接形成后, nystatin穿孔约须1～5 min。

文中数据以x±s表示, 差异显著性用t检验。

2结果

2.1KATP 通道特性研究

KATP 是启动β细胞膜去极化的关键通道［5,6,9］。在贴附式构型下, 用高钾普通电极内液记录静息电位时(电极保持电压Vh为0 mV)的膜电流。记录到特征性的、 呈簇状快速开闭、 幅度约5 pA的外向单通道电流。此电流能被KATP通道的特异性阻断剂tolbutamide 200μmol/L阻断。上述所有特征表明, 此电流即为KATP通道电流［9,15,16］。

不同Vh下KATP的I-V曲线, 用一元线性回归分析法计算KATP通道的电导值。 当Vh＞－60 mV时, 电导值约为65.4 pS; Vh＜－60 mV时,约为31.3 pS; 反转电位约在－60 mV。可见, KATP通道具有部分内向整流性质(n=8)。

2.2KATP 阻断后的全细胞钾电流

在穿孔膜片箝构型下,普通胞外液中加200 μmol/L tolbutamide以阻断KATP通道,记录不同去极化电压下的全细胞电流(包括内流和外流两部分)。加入1 μmol/L TTX和1 mmol/L CdCl2, 内流成分消失; 置换为20 mmol/L tEA外液,则外流成分消失。说明上述电流由K+、Ca2+、Na+通道的开放组成。

为研究外向K+电流的特性, 在含200 μmol/L tolbutamide和1 mmol/L CdCl2的胞外液中,记录不同去极化电压下的全细胞外向电流并作出其外向峰电流I-V曲线(n=6)。外向电流在去极化中被缓慢激活,从开始激活到达到最大值的过程可用单指数拟合, 20 mV下时间常数为20.3±1.5 ms(n=6)。由图2B的I-V曲线可知,该通道只有当去极化电压大于－10 mV时才被激活, 表明该通道为延迟整流型K+通道(KDR通道)。

为探讨β细胞上KATP通道和KDR通道两种K+通道的相对丰度, 比较在不加g1ucose外液、 加200 μmol/L tolbutamide外液和20 mmol/L TEA-Cl外液(TEA)中同一去极化强度下的外向K+电流, 实验中均加1 mmol/L CdCl2以阻断Ca2+电流(n=3)。未加药时, 外向电流为所有的K+电流之和, 平均约800 pA; 加200 μmmol/L tolbutamide时, KATP通道被阻断, 主要为KDR通道,约200 pA; 再加入20 mmol/L TEA-Cl, 两种通道均几乎被阻断, 外向电流不足30 pA。 可见, KATP贡献的电流是KDR的3倍。

2.3钙电流的记录与鉴别

在含1 μmol/L TTX, 200 μmol/L tolbutamide和20 mmol/L TEA的外液中,用穿孔膜片箝记录不同去极化电压下的内向钙电流, 用平均钙电流作I-V曲线, 典型结果见图4 (n=6)。 内向钙电流一般在－40 mV开始明显, 0 mV左右达到40～60 pA的峰值。

由于无低电压激活的T型Ca2+通道的特异性阻断剂, 让膜电位保持电位在－50 mV,可使T型Ca2+通道一直处于失活状态［17］。在此条件下，记录L-型钙通道阻断剂nifedipine (10 μmol/L)和非选择性钙通道阻断剂CdCl2(1 mmol/L)对0 mV去极化下全细胞钙电流的阻断作用(n=3)。 发现nifedipine可消除70%～75%的钙电流,而CdCl2几乎可以将钙电流完全阻断, 这说明大鼠β细胞上除L-型钙通道外还有其它类型的高电压激活的钙通道。

2.4钠电流的记录

在穿孔膜片箝构型下, 记录在含1 mmol/L CdCl2, 200 μmol/L tolbutamide和20 mmol/L TEA外液中,不同去极化电压的内向Na+电流, 约有50%的细胞表现出明显的快速活化、立即失活的Na电流。该电流约在10 mV左右达到峰值, 峰电流约200～400 pA,1 μmol/L TTX 可将其完全阻断。然而, 还有50%的细胞未记录到明显的内向电流(n=5)。

3讨论

实验采用细胞贴附式记录和穿孔膜片箝记录技术, 研究了大鼠胰腺β细胞上几种重要离子通道的电生理学特性。结果表明: KATP通道的内流电导约65 pS,外流电导约31 pS; KDR的电流在－10 mV激活, 需延迟20 ms才能达到最大值, KDR通道电流只有KATP的1/3; 钙电流约在0 mV前后达到40～60 pA的峰值, L-钙通道是大鼠β细胞上主要的钙通道, 并含有其它类型高电压激活的钙通道; 钠电流约在10 mV达到200～400 pA的峰值, 但约有一半细胞无钠电流。

本文数据表明, β细胞KATP通道的内流电导比外流电导要大, 相差约1倍, 这种差异有何生理作用?一种作用可能是使细胞在超极化扰动下快速回到静息状态,因为β细胞静息时KATP外流电流较活跃, 一旦因K+外流过多形成超极化扰动, KATP通道就可能与Na+、 Ca2+等静息电流<