摘要：采用主动回避法进行大鼠学习记忆训练, 选出学习成绩好和差的大鼠, 用原位杂交、免疫细胞化学结合图像分析方法观察nov基因表达的差异。结果显示, nov mRNA和NOV蛋白阳性神经元主要分布于海马、扣带皮质和联合皮质锥体层、基底神经节和下丘脑等脑区。好成绩组NOV蛋白免疫反应最强, 阳性细胞最多, 差成绩组nov基因的表达比假性条件反射组的表达稍强。nov mRNA的表达在各组之间无明显的差异。以上结果提示, nov基因可能参与学习记忆的调控过程, 这种调控发生在NOV蛋白翻译水平。肾母细胞瘤过度表达基因(nephroblastoma overexpressed gene, nov)是原癌基因的一种, 属于新近发现的一个即刻早期基因家族的成员,编码产物(NOV蛋白)是一种胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)结合蛋白(IGF-binding protein, IGFBP),参与生长发育和细胞信息传递过程[1~3]。先前的研究已经证实, nov基因与中枢神经系统的发育和分化密切相关,个体和种系发生过程中, 随神经系统的发育和功能分化, nov基因的表达逐渐增强[4~9]。通过构建反义nov基因真核表达载体, 转染培养神经元, 抑制nov基因的表达后, 兴奋性氨基酸递质的分泌量显著降低, 提示nov基因可能在学习记忆过程中起作用(苏炳银等, 待发表资料)。 为了深入了解 nov 基因与学习记忆的关系, 本实验采用主动回避法训练大鼠, 检测学习记忆成绩好和差的大鼠脑nov基因的表达状况, 观察nov在大鼠学习记忆中的作用。回避法训练大鼠, 检测学习记忆成绩好和差的大鼠脑nov基因的表达状况, 观察nov在大鼠学习记忆中的作用。

１材料和方法

1.1 动物 2月龄正常Wistar大鼠30只, 常规饲养于23~24℃通风良好的房间。

1.2 主动回避反应 采用爬杆主动回避反应箱, 箱子大小为30 cm×30 cm×30 cm, 中央有一圆形有机玻璃柱, 箱底由不锈钢棒组成, 间隔1 cm, 可通交流电产生footshock, 以灯光(25 W)为条件刺激, 电击为非条件刺激, 电压为20~30 V。爬杆反应的习得: 第一次训练时, 先将大鼠置于箱内适应1~2 min, 然后灯亮, 5 s后给予电击。 在头3次训练时, 如果电击后5~10 s内大鼠不爬到杆上, 则轻轻将鼠放置杆上, 使大鼠学会爬杆。在随后的训练中, 如果电击5 s内大鼠不爬杆, 则持续电击30 s, 30 s内大鼠都不爬杆则由实验者放到杆上。每次训练的间隔时间为30~60 s。以灯亮5 s内大鼠自动爬杆为主动回避反应(AAR)。如果大鼠爬到杆上30 s仍然不下来, 实验者轻轻将大鼠拿下来。每天训练20次。以"假性条件反射(pseudoconditioning, PC)”训练作为对照组, 动物分别接受同样强度的灯光和电刺激, 但两种刺激之间没有配对。

1.3 免疫组织化学法 兔抗NOV抗体由法国巴黎第七大学居里研究所提供。免疫组化染色SPTM试剂盒为美国ZYMED公司的产品, 购自北京中山生物试剂有限公司。DAB为美国Sigma公司的产品。

用ABC方法行免疫组织化学染色: 将切片置于3%的H2O2中处理15 min, 封闭内源性过氧化物酶的活性。第一抗体为兔抗NOV抗体(工作浓度1∶250),于4℃孵育过夜,用生物素标记的羊抗兔IgG(工作浓度1∶200),于37℃孵育2 h,以辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(工作浓度1∶200), 于37℃孵育1 h,DAB显色液进行显色。对照实验用兔血清替代兔抗NOV抗体进行孵育,其余操作与上述一致。

1.4 原位杂交组织化学法 cRNA核酸探针的制备: 含nov原癌基因重组质粒 (pBX1.5)按氯化钙法操作。经宿主菌HB101扩增, 按碱裂解法分离纯化, 所扩增质粒 (长度4.5 kb)经限制性内切酶XbaI酶切为3.5和1 kb两个片断。回收含T7启动子的3.5 kb片断, 采用地高辛标记系统体外转录成含624 nt的cRNA探针。

原位杂交组织化学染色程序: 用漂浮法进行nov mRNA原位杂交组织化学染色: 0.1 mol/L PBS (pH 7.2)漂洗5 min×3次, 0.1 mol/L 甘氨酸/PBS漂洗5 min, 0.3% Triton X-100/PBS漂洗25 min, 蛋白酶K (2 mg/L)37℃孵育25 min (于0.1 mol/L Tris·HCl pH 8.0; 0.05 mol/L EDTA缓冲液中), 4%多聚甲醛中漂洗5 min, 0.1 mol/L PBS漂洗5 min×3次, 浸入新配制的0.1 mol/L Tris·HCl (pH 8.0, 含有0.25%乙酸酐)5 min, 2×SSC 10 min, 切片浸入含有0.5 mg/L 地高辛标记的 nov cRNA探针的杂交液中, 42℃反应24 h后, 4×SSC中漂洗15 min, 2×SSC (含有RNAase A 20 mg/L)中漂洗30 min (37℃), 1×SSC、0.5×SSC中各漂洗10 min (37℃), 0.05 mol/L PBS漂洗10 min×2次, 将切片转入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体中孵育4 h (37℃), 0.05 mol/L PBS漂洗10 min×3次, TSM1、TSM2中各漂洗10 min×2次, 继之用NBT/BCIP显色液显色[7], 室温3~5 h, 然后裱片、脱水、DPX封片。

为了检验本实验的专一性和可靠性, 做了以下阴性对照: (1) 将切片用RNA酶进行预处理后杂交; (2) 以不含探针的杂交缓冲液取代含Dig-nov-cRNA探针的杂交液; (3) 以正常羊血清代替羊抗Dig抗体-Ap复合物。

1.5图像分析及数据统计 用Tiger920图像分析系统 (重庆大学)测定各组大鼠nov mRNA和NOV蛋白的相对含量。光学显微镜下 (×100), 在相应脑区或核团, 每例随机测10个单位面积, 每组共测50个单位面积。 经计算机打印出每个单位面积nov mRNA和NOV蛋白免疫反应阳性物质相对含量的平均值及标准差, 进行t检验统计学处理。

2结果

２.１ 主动回避训练结果

经主动回避训练选出2组模型动物: 好成绩组 (high ability of learning and memroy, HALM), 训练至第6天 (d 6)的正确率达90.6%, 差成绩组 (low ability of learning and memroy, LALM) d 6的正确率为42.7%。加上假性条件反射组和正常成年组, 每组选取大鼠各5只, 进行nov基因表达的检测。

2.2 NOV蛋白和mRNA在正常成年大鼠脑的表达

NOV蛋白免疫反应阳性神经元分布于大鼠扣带皮质、纹状皮质、颞叶皮质的内外锥体层和多形细胞层、海马裂和CA1~CA4区的锥体层、基底核、丘脑和下丘脑的部分核团。阳性细胞较少, 阳性反应较弱 。

2.3学习记忆训练后NOV蛋白和mRNA表达的差异

2.3.1NOV蛋白表达的差异 好成绩组大鼠NOV蛋白免疫反应阳性神经元在尾壳核、苍白球 、扣带皮质 、联合皮质的多形细胞层和内外锥体层、海马裂和CA1~CA4区的锥体层 等脑区均有较多的分布, 阳性反应强。假条件反射组仅有基础表达, 差成绩组nov的表达比假性条件反射组稍强, 但与好成绩组差异明显 。

2.3.2nov mRNA表达的差异 nov mRNA的定位与NOV蛋白的分布区域吻合, 主要分布于海马、扣带皮质和联合皮质的锥体层以及苍白球、尾壳核和下丘脑等脑区, 但它的表达在不同组别间无明显的差异 。

3讨论

大鼠脑nov mRNA和NOV蛋白阳性神经元主要分布在扣带前皮质、扣带后皮质至纹状皮质等广泛的皮质区域、海马各区及下丘脑背侧区。学习记忆能力强的大鼠nov基因的表达明显高于学习记忆能力差的大鼠。这提示nov基因可能参与了学习记忆过程。从阳性神经元的分布来看, 以上阳性区域多属于边缘系统, 从已知的功能看, 边缘系统主要与学习记忆、情绪行为反应有关。其组织学定位表明了nov的表达与学习记忆密切相关。

用基因工程的方法构建反义nov基因真核表达载体, 转染培养神经元, 表达反义RNA, 抑制nov基因的表达后, 培养神经元谷氨酸等兴奋性氨基酸递质的分泌量显著降低, 已有的研究表明这些递质与学习记忆有关, 提示nov基因可能通过调控神经递质的分泌影响学习记忆。

熊鹰等的研究表明, 大鼠生后学习记忆的发育规律是生后早期学习能力较弱, 成年时学习能力最强, 之后逐渐降低 (熊鹰等, 待发表资料)。这与人和大鼠中枢神经系统发育过程中nov的表达规律相吻合。我们先前的研究证实, 在人胚胎发育过程中nov基因在中枢神经系统的表达逐渐升高, 到胚胎9月时广泛表达于中枢神经系统[4]。出生后大鼠中枢神经系统nov基因的表达逐渐升高, 成年时达高峰。表明nov与中枢神经系统的功能分化密切相关[5~7]。对处于不同进化阶段动物中枢神经系统nov基因表达的研究结果表明, 低等脊椎动物鲢的nov mRNA和NOV蛋白阳性神经元较少, 阳性信号亦较弱, 分布于较为低级的中枢。鸟类和哺乳类脑的nov mRNA和NOV蛋白阳性神经元分布非常广泛, 从低等脊椎动物到高等脊椎动物的进化过程中, nov基因的表达逐渐升高, 表达部位由低级中枢向高级中枢扩展。表明nov基因与中枢神经系统功能分化密切相关, 而学习记忆是脑的高级功能[8, 9]。

在NOV蛋白的羧基末端存在一个IGFBP样结构域, 提示它在IGF信号通路中起作用。最近的研究还发现, NOV是一种分泌性糖蛋白, 它可能与细胞外基质相联系[8]。这一结果支持nov可能在细胞与细胞间通讯过程中起作用的观点。

总之, 形态学、行为学和机理方面的研究结果表明, nov基因可能参与大鼠学习记忆的调控, 这种调控发生在NOV蛋白的翻译水平。

参考文献

［1］Martinerie C, Viegas-pequignot E, Guenard I et al. Physical mapping of human loci homologous to the chicken nov proto-oncogene. Oncogene, 1992, 7 (12): 2529~2534.

[２]Martinerie C, Chevalier G, Rauscher FJ et al. Regulation of nov by WT1: a potential role for nov in nephrogenesis. Oncogene, 1996, 12 (7): 1479~1492.

[３]Joliot V, Martinerie C