生理学报 1999年第5期第51卷

刘萍；陈汇；程焰；曾繁典；同济医科大学临床药理研究所；武汉；430030；唐朝枢；北京医科大学心血管基础研究所；北京刘萍；陈汇；程焰；曾繁典；唐朝枢

关键词：骨桥蛋白；基质Gla蛋白；球囊剥脱术；再狭窄；主动脉

摘要：本实验采用球囊剥脱大鼠主动脉内皮造成血管内膜损伤的动物模型, 以Northern印迹分析、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,研究大鼠胸主动脉内膜损伤后血管中的骨桥蛋白(osteopontin, OPN)和基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)mRNA水平的动态变化。与无内皮损伤血管比较, 损伤后的血管中OPN和MGP的mRNA水平明显升高, 损伤后1、7、14 d,两者的mRNA水平逐渐升高。血管损伤后21 d左右OPN和MGP mRNA水平开始下降。结果表明: 血管内膜损伤后, OPN mRNA和MGP mRNA水平呈现先升高后下降的动态变化。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖是冠状动脉球囊扩张术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)术后再狭窄(restenosis, RS)形成的中心环节之一^［1］,VSMC增殖能力与其表型密切相关。根据结构和功能的不同,VSMC分为收缩和合成两种表型。由收缩表型向合成表型转化是VSMC增殖的必要条件。近年来人们用差异显示的分子生物学技术对培养的VSMC表型转化的基因标志的研究发现,骨桥蛋白(osteopontin, OPN)和基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)基因在VSMC由收缩型转变为合成型中有重要地位,是VSMC表型分化的Marker基因^［2］。本实验旨在研究动脉内膜损伤后, 血管中OPN和MGP的mRNA水平的动态变化,为两者参与RS形成的病理生理机制提供线索。

1材料和方法

1.1实验动物及分组雄性Wistar大鼠, 体重250～300 g,由北京医科大学实验动物科学部提供, 随机分为5组: 血管损伤前组(B组), 血管损伤后1 d组(I组), 损伤后7 d组(I7组), 损伤后14 d组(I14组), 损伤后21 d组(I21组), 每组4只。

1.2主要试剂OPN探针和GAPDH 探针由美国华盛顿大学Dr. Cecilia Giachelli馈赠, 探针长度分别为1.0和1.3 kb,均为双链cDNA探针。焦炭酸二乙酯(DEPC)、琼脂糖、鲑鱼精DNA (ssDNA)、牛血清白蛋白(BSA,组分V)、聚蔗糖(Ficoll400)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴化乙啶(EB)、甲酰胺、3-N-吗啡啉-丙磺酸(MOPS)等购自Sigma公司。尼龙膜购自Gibco公司。RNA提取试剂盒和随机引物试剂盒购自Promega公司;逆转录酶、PCR marker等购自北京华美公司; Taq DNA聚合酶购自天象人生物工程公司; StuI内切酶购自北京中山公司;α-³²P-dCTP购自Dupont公司, 放射性活度为111 TBq/mmol。

1.3大鼠胸主动脉球囊内皮剥脱术模型制备及组织总RNA提取按Daemen方法改进^［3］。5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后, 颈部皮肤用碘酒和酒精常规消毒, 剪开皮肤约2～3 cm长, 依次分离皮下组织、肌肉并暴露气管,在气管左侧游离左颈总动脉1～1.5 cm, 将远心端结扎, 近心端用动脉夹钳夹后, 于颈动脉远端做一切口,将2F球囊导管(Monarch产品)插入至腹主动脉, 注入0.1 ml生理盐水使球囊扩张, 然后回拉球囊至左颈总动脉与胸主动脉交叉处,回抽生理盐水后重新送回导管, 在3个相隔120° 的方向各重复3次共9次, 最后拔出导管, 结扎左侧颈总动脉,缝合皮下脂肪及皮肤切口。术后常规肌注青霉素80万单位以预防感染。血管损伤前组除了不插入球囊导管扩张胸主动脉外, 其余操作同上。分别于损伤前,损伤后1、7、14和21 d处死动物, 再以异硫氰酸胍一步法^［4］提取大鼠胸主动脉RNA, 以260 nm紫外光吸收率测定RNA含量。经测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.7～2.0之间。说明RNA的纯度较高。提取的RNA于－70℃保存,待Northern印迹分析和RT-PCR。

1.4Northern印迹分析血管壁OPN mRNA20 μg RNA以甲醛变性的1.2%琼脂糖凝胶电泳后, 将RNA以毛细管洗脱法转移至尼龙膜上。DNA探针采用随机引物法标记。应用42℃甲酰胺杂交体系 (50% 甲酰胺, 5×Denhardt液含0.1% Ficoll, 0.1% PVP, 0.1% BSA, 0.1% SDS和变性ssDNA 200 mg/L) 预杂交6 h, 更换杂交液并加入α-³²P-dCTP标记的探针, 在42℃水浴摇床中杂交滤膜24 h,未杂交上的探针分别通过2×SSC (NaCl 0.3 mol/L, 柠檬酸三钠0.03 mol/L) 和0.5% SDS 24℃溶液中振荡5 min; 2×SSC和0.1% SDS 24℃ 漂洗10 min; 37℃下在0.1×SSC和0.1% SDS漂洗10 min;2×SSC和0.1%SDS中在65℃ 下漂洗5 min等不同浓度、温度的SSC/SDS溶液洗脱, 杂交滤膜封入保鲜膜压X线片后置－70℃自显影3 d。将杂交过的尼龙膜在0.1% 的SDS液中煮沸10～15 min, 以Monitor监测膜表面无同位素后, 在4℃下保存, 再与GAPDH cDNA探针杂交。杂交结果经过LeicaQ550计算机图像处理系统测定光密度,以OPN与GAPDH的光密度比值作为OPN的相对表达量。

1.5逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测血管壁MGP mRNA^［5］

逆转录反应: 在含有提取的组织RNA 2.5 μg, 5 mmol/L dNTPs 2 μl,5×逆转录酶缓冲液4 μl, 1 mol/L DTT 0.2 μl, 随机引物 0.5 μl, 和去离子水5.3 μl的反应体系中70℃变性5 min, 再加入逆转录酶32 U, 使整个反应体系为20 μl, 42℃反应60 min。再加入50 μl TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA), 混匀后取7 μl进行PCR扩增。 阴性对照是以不含RNA的DEPC水4 μl代替组织RNA的4 μl,其余完全相同。

PCR扩增反应:我们针对MGP基因^［6］设计并合成了两段引物,长度分别为21和20 bp:

Upper primer: MGP碱基序列51位至71位5′ CCTGTGCTATGAATCTCACGA 3′

Lower primer: MGP碱基序列382位至401位5′ GCAACGAACACGAATCTGTG 3′

参照物GAPDH (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase), 上下游引物长度均为20bp:

Upper primer: GAPDH碱基序列506位至526位5′ TCCCTCAAGATTGTCAGCAA 3′

Lower primer: GAPDH碱基序列795位至814位5′ AGATCCACAACGGATACATT 3′

100 μl的反应体系, 包括逆转录产物7 μl, 10×Taq酶缓冲液10 μl, 上游引物50 pmol, 下游引物50 pmol, Taq酶2.5 U,25 mmol/L MgCl₂ 8 μl, 5 mmol/L dNTPs 4 μl,α-³²P-dCTP 18.5 kBq, 溶于67.5 μl去离子水中, 扩增条件为94℃ 1 min,42℃ 1.5 min,72℃ 2 min, 循环数分别为30 (MGP)和25(GAPDH)。

限制性内切酶酶切反应: 50 μl酶切体系, 包括5 μl MGP的PCR扩增产物, 5 U StuⅠ, 10×酶切缓冲液5 μl, 溶于39 μl去离子水中, 37℃酶切1 h。

电泳及结果检测: 将扩增产物取10μl, 以PCR Marker作为分子量标准, 行1.5%的琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/ml EB), 电泳缓冲液为1×TBE(0.09 mol/L硼酸, 2 mmol/L EDTA, pH 8.0), 在40 V/14 cm电压下电泳2～3 h, 紫外灯下照相观察结果。 切取宽约2 mm的含有荧光条带的凝胶, 应用液体闪烁计数仪进行放射性测定。以MGP与GAPDH的 ～³²P放射强度的比值进行作为MGP mRNA的相对表达量。

将StuⅠ 酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下照相观察结果。

1.6统计学处理结果用(x±s)表示, 以组间t检验法进行统计学处理。

2结果

2.1大鼠胸主动脉内膜损伤后管壁中OPN mRNA水平的动态变化

Northern杂交结果表明, 在大鼠正常的胸主动脉, OPN mRNA 水平很低(0.019±0.003,n=4)。动脉内皮剥脱术后1 d其mRNA升高到0.75±0.07, 与血管损伤前组比较升高了37.6倍,有极显著性差异(P＜0.01)。动脉损伤后7 d,OPN的mRNA水平为1.01±0.07,较动脉损伤后1 d组增加了34.5%(P＜0.05),动脉损伤后14 d, 其mRNA水平增加到1.41±0.10, 和7 d组比较增加了39.1%(P＜0.01),动脉内膜损伤后21 d,其mRNA的水平下降到1.08±0.17,与14 d组比较降低了23.4%(P＜0.05),但仍明显高于血管损伤前组(P＜0.01)。在此过程中,GAPDH mRNA水平无明显变化(图1,2)。

图1大鼠胸主动脉球囊损伤后骨桥蛋白 (OPN) mRNA水平的动态变化

fig.1Autoradiograph shows the dynamic change of osteopontin (OPN) expression in rat′s thoracic aorta damaged by balloon catheter(Northern blot) B: before artery injure. I1: 1 d after artery injure. I7: 7 d after artery injure. I14: 14 d after artery injure. I21: 21 d after artery injure.

图2大鼠胸主动脉球囊损伤后骨桥蛋白 (OPN) mRNA表达的动态变化

Fig.2Dynamic change of osteopontin mRNA expression in damaged rat thoracic a