摘要：在急性分离的大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞上, 应用全细胞膜片箝技术观察了预加催产素(oxytocin, OT)对GABA激活电流的调制作用。结果如下: (1) 大多数细胞(48/52, 90.5%)对GABA敏感。(2) OT可引起51.3% (20/39)的受检细胞出现外向膜电流; 43.6% (17/39)无明显膜反应; 5.1%(2/39)出现内向膜电流。(3)预加OT (10－12～10－9 mol/L)30～90 s后, 大部分GABA激活电流增加(33/39, 84.6%); 少数无明显反应(4/39, 10.3%)或略有抑制(2/39, 5.1%)。GABA (10－4 mol/L)增强作用为浓度依赖性的, 在OT浓度为10－12、 10－11、 10－10、 10－9 mol/L时, GABA激活电流的增强分别为: 24.1±7.6%(n=6), 33.4±6.9% (n=9), 40.2±6.5% (n=13), 67.2±14.8%(n=5)。 当OT浓度升高(10－８及10－７ mol/L)时, GABA激活电流不但不增高, 反而被抑制。(4) 预加OT后, GABA激活电流量-效曲线的Kd值降低, 最大反应浓度增加。 (5) 预加OT和未预加OT的电流-电压曲线显示, 其翻转电位均在0 mV左右。以上结果提示: OT受体激活后可能通过相应的胞内转导机制增强GABA激活电流, 从而在初级感觉神经元水平加强GABA的突触前抑制作用而减弱感觉信息的传递。

越来越多的资料表明[1], 催产素(oxytoxin, OT)除发挥经典激素的作用外, 在中枢神经系统内还作为递质/调质发挥广泛的生理作用。应用免疫组织化学方法[2]发现, 50～60%的背根神经节(dorsal rootganglion, DRG) 细胞内存在OT; 行为学及电生理方法[3]揭示, OT可能在脊髓水平参与感觉信息的传递。 而GABA 可作用于DRG细胞膜上的GABAA受体, 在初级感觉神经元水平调节感觉信息的传递[4,5]。因而OT受体与GABAA受体有可能共存于DRG神经元膜上。为阐明OT受体与GABA受体共存的生理意义, 本文采用全细胞膜片箝技术, 以GABA激活电流峰值为指标, 观察OT对 GABAA受体的调制作用。 初步工作曾以摘要形式在另处报道[6]。

１材料和方法

有关大鼠DRG神经元标本的分离方法及全细胞膜片箝记录技术简述如下。实验动物为出生后1个月左右的雄性Wistar大鼠。击昏断头后, 迅速切开背部皮肤, 沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨, 取出胸腰段脊柱, 由脊柱正中剖开成两半, 置于O2饱和Dubecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)液内, 溶液pH为7.4, 渗透压为340 mOsm/kg。从剖开的椎管内侧取出神经节及相连的神经根(腹, 背根)和脊神经。在体视显微镜下, 用精细角膜剪及游丝镊仔细剪除相连神经和周围的结缔组织被膜, 将清除干净的DRG尽可能地剪碎, 置于培养瓶内。然后加入胰蛋白酶(type Ⅲ, Sigma)0.5 mg/ml, 胶原蛋白酶(type ⅠA, Sigma) 1.0 mg/ml, DNase (typeⅢ, Sigma)0.1 mg/ml, 置于恒温振荡水浴器(35℃, 80次/min)中40 min。孵育毕, 加入1.25 mg/ml胰蛋白酶抑制剂 (type Ⅱ-S, Sigma)终止酶的消化作用。将上述酶和机械分离的DRG细胞转移至一35 mm培养皿内, 放在倒置显微镜的载物台上至少30 min。

全细胞膜片箝记录所用仪器为国产PC-2型膜片箝放大器(华中理工大学自动化控制系研制)。电极内液成分为(mmol/L): KCl 140, MgCl2 2.5, HEPES 10, EGTA 11, 电极电阻1～4 MΩ。灌流用外液成分(mmol/L): NaCl 150, KCl 5, CaCl2 2.5, MgCl2 1, HEPES 10, D-glucose 10。在电极与细胞膜之间形成高阻(1～5 GΩ)封接后, 进一步将膜吸穿, 调节电容和串联电阻补偿。保持电压(HP)为 -60 mV, 膜电流应用低通(10 Hz, -30dB)滤波, 直接描记于记录仪上, 技术细节参见另文[7]。

所用药物 GABA (Sigma)、 bicuculline (Sigma)、 OT (广州明兴制药厂)均用外液配制, 并将其pH调至7.4。 通过微操纵器移动自制的快速换液装置的排管给药, 每管的直径(O.D/I.D)为0.5/0.3 mm, 管口距所记录的细胞100 μm, 实验在室温20～30℃范围进行。受检细胞直径系根据目镜测微标尺所测定的细胞长轴和短轴计算得出的平均值来表示。

GABA激活电流值以means±SE表示。采用配对t检验进行统计学分析。

2结果

本实验所检测的大鼠新鲜分离DRG细胞呈圆形或椭圆形, 细胞膜透明、完整, 其中部分细胞连有呈卷曲状被离断的轴索突起残端。细胞直径在15～45 μm之间, 大多数为20～30 μm。

2.1GABAA受体介导的膜电流

实验在保持电压(HP)为 -60 mV下进行, 绝大多数受检细胞对GABA (10－6～10－3 mol/L)产生反应(48/52, 90.5%)。其激活的膜电流为一浓度依赖性内向电流, 有明显的失敏现象, 并能为GABAA受体拮抗剂bicuculline阻断(图1A)。

图1. DRG神经元的GABA激活电流及OT引起的膜电流 Fig.1.GABA-activated currents and OT-induced membrane currents in DRG neurons. A. GABA-activated currents were blocked by GABAA receptor antagonist bicuculline (10－4 mol/L). B. OT-induced membrane currents: (1) no apparent response; (2) outward current; (3) inward current.

2.2OT引起的膜反应

39个DRG细胞对OT (10－12～10－9 mol/L)的反应是: (1) OT可引起51.3%(20/39)的受检细胞出现外向膜电流; (2) 43.6%(17/39)细胞无明显膜电流反应; (3) 5.1%(2/39)细胞出现内向膜电流。 与GABA激活电流相比, OT激活的膜电流反应幅度较小且无明显失敏现象(图1B)。OT浓度的高低与是否引起膜电流反应及反应幅度的大小没有明显关系, 其离子基础有待进一步探讨。

2.3OT对GABA激活电流的调制作用

在39个DRG细胞上, 预加OT (10－12～10－9 mol/L)30～90s后加GABA(10－4 mol/L), 绝大多数细胞可出现GABA激活电流的增加(33/39, 84.6%);小部分细胞预加OT对GABA激活电流无明显影响(4/39, 10.3%);少数细胞使GABA 激活电流减少(2/39, 5.1%)。 OT对GABA激活电流的增强作用主要表现在电流峰值(Ip 值)的增加上, 而对稳态值(Iss值)的部分无明显影响。电流峰值的增加有浓度依赖性: 10－12、 10－11、 10－10、 10－9 mol/L OT使10－4 mol/L GABA激活电流分别增加24.1±7.6%(n=6); 33.4±6.9%(n=9); 40.2±6.5%(n=13); 67.2±14.8%(n=5)。OT使GABA电流峰值的增加在冲洗4 min后完全恢复, 因而其作用为可逆性的 (图2)。

当OT浓度为10－８ 和10－７ mol/L时, 预加OT对GABA激活电流的增强作用消失, 甚至出现抑制作用, 其抑制率均在20%, 恢复时间明显延长(10～20 min)(图2)。该效应可能为肽类的非特异性作用。

图2.OT对GABA (10-4 mol/L) 激活电流的增强作用

Fig. 2.Potentiation of the GABA (10－4 mol/L)-activated currents by OT. A. The currents activated by 10－4 mol/L GABA with pretreatment of OT on different concentrations (10－12～10－７ mol/L). Records are sequential (from left to right) current traces obtained from a single DRG neuron (HP=-60 mV).B. The concentration-response curve for OT potentiation on the GABA (10－4 mol/L)-activated currents. Each point represents the means±SEM from 5～13 DRG neurons.

2．4预加OT和未预加OT (10－10 mol/L)时GABA激活电流的量效关系

当预加OT (10－10 mol/L)30 s后再加10－6 mol/L ～10－3 mol/L GABA时, GABA激活电流值分别增加0%(n=5); 23±4.6%(n=4); 40.2±6.5%(n=13); 30.1±8.1%(n=5)(means±SEM), 差别均有显著性(Ｐ＜0.05)。 由图3可见, 预加OT之GABA激活电流的量-效曲线(●---●)与对照曲线(○---○)相比, 曲线明显上移。在最大GABA浓度(10－3 mol/L)时, GABA激活电流值较对照值增加约30%。两者之Kd值非常接近, 分别为3×10－5 mol/L 和2×10－5 mol/L。

图3.预加及未预加OT时GABA的浓度-量效曲线

Fig. 3.Concentration-response relationships for GABA with and without preapplication of OT. In the concentration-response curve for GABA without preapplication of OT, each point represents the means±SEM of GABA-activated currents of 4～8 neurons (HP=-60 mV). All GABA-activated currents were normalized to the peak current induced by 10－3 mol/L GABA. The curve is the best fit of the data to the logistic equation Y=Emax/[1±(Kd/C)n], where C is the concentration of GABA, Y is the fraction of the maximum value, and Kd, the dissociation constant of the GABAA receptor. The curve is drawn according to the equation described above assuming Hill coefficient(n)=1.0. P＜0.05, compared with the GABA-activated currents without preapplication of OT.

2.5预加OT前后GABA激活电流的电流电压关系

由图4的电流-电压(I-V)关系曲线可见, 预加OT (10－10 mol/L)的GABA激活电流(OT+GABA)值与对照(GABA)值相比, 在膜电压由-80 mV～+20 mV范围各电压点的增大呈线性改变。两条曲线之逆转电位值均接近于0 mV。

图4.OT (10-10 mol/L) 预处理及未预处理时GABA激活电流的电流-电压关系

Fig. 4.I-V relationship for GABA-activated currents with and without pretreatment of OT (10－10 mol/L).Pretreatment with OT potentiated GABA-activated currents at all holding potentials. The<