摘要：实验以饮水行为及脑内c-fos表达为指标, 观察刺激大鼠穹窿下器官(SFO)的效应。结果显示, 刺激SFO能诱发明显的饮水行为, 与此同时,前脑8个部位(终板血管器官、正中视前核、室旁核、视上核、下丘脑外侧区、穹窿周核背侧区、丘脑联合核和无名质)和后脑3个部位(最后区、孤束核和臂旁外侧核)的Fos蛋白表达明显增强。免疫组化双重染色结果显示,刺激SFO能诱导视上核和室旁核中部分神经元呈Fos蛋白和加压素共同表达。脑室注射阿托品能部分阻断刺激SFO诱发的饮水行为, 脑内上述各部位所诱导的Fos蛋白表达也明显减弱。以上结果提示, m胆碱能机制参与刺激SFO诱发的饮水行为和脑内Fos蛋白的表达。饮水行为在体液平衡调节中起重要作用[1], 其中枢调节机制尚不完全清楚。穹窿下器官(subfornical organ, SFO)是最早明确和饮水行为有关的一个室周器官,被认为是整合外周和中枢体液平衡信号的关键部位[1~4]。SFO参与低血容量性脱水、细胞性脱水以及混合性脱水诱发的饮水[1,5,6]。多种致渴因子(如血管紧张素Ⅱ,氨甲酰胆碱)注射到SFO以及电刺激该部位都能诱发饮水[6~10]。

c-fos是一种即刻快速反应基因, 可被神经递质、电刺激等多种刺激诱导而快速表达, 并作为神经元激活的标志。80年代末90年代初, c-fos技术被用于渴机制的研究,并已成为研究饮水行为中枢机制的一种重要工具[11,12]。

形态学研究表明, SFO和许多脑区之间存在直接的神经联系。如正中视前核(median preoptic nucleus, MnPO)、终板血管器官(organum vasculosum of the lamina terminalis, OVLT)、室旁核(paraventricular nucleus, PVN)、视上核(supraoptic nucleus, SON)、臂旁外侧核(lateral parabrachial nucleus, LPBN)、孤束核(solitary tract nucleus, NST)[5,13,14]等。行为学研究已表明, 这些脑区和饮水行为有关[5]; 最近有报道, 向SFO微量注射血管紧张素Ⅱ、氨甲酰胆碱或血管紧张素I在诱发饮水的同时,可诱导这些脑区的2-DG摄取或Fos蛋白表达[7,9], 但是刺激SFO能否诱导这些脑区的Fos蛋白表达, 至今还未见报道。

sFO内有胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)免疫反应阳性神经元[3,5,15]和胆碱能传入神经末梢[16]。在和SFO有联系的许多与饮水有关的核团内,也都有胆碱能神经支配[16]; 但胆碱能机制是否参与刺激SFO的效应有待确定。

为此, 我们观察刺激SFO诱导的饮水行为和脑内Fos蛋白表达, 以及脑室注射阿托品对其的影响, 旨在探讨刺激SFO诱发饮水行为和脑内Fos蛋白表达的胆碱能机制。此外,实验中还观察了刺激SFO诱导的PVN 和SON中加压素(vasopressin,VP)能神经元激活的情况。

１材料和方法

1.1 实验动物和分组实验用雄性Sprague-Dawley成年大鼠(210~250 g),由苏州大学实验动物中心提供。在正常温控光照与自由摄食饮水条件下饲养一周后进行实验。实验分两部分: (1)刺激SFO。动物随机分为三组: SFO刺激组和两个对照组(SFO假刺激组、非SFO刺激组)。假刺激组的实验操作除刺激器不开通外,其他步骤与刺激组相同; 非SFO刺激组的刺激部位在SFO以外, 其他步骤同刺激组。(2)脑室注射阿托品后刺激SFO。动物随机分为两组, 侧脑室注射阿托品+刺激SFO的实验组和侧脑室注射生理盐水+刺激SFO的对照组。

1.2 实验动物的准备

1.2.1 手术操作(1)SFO内埋电极: 大鼠经4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉后, 固定于立体定向仪上, 沿矢状轴作正中切口, 参照Paxinos和Watson图谱,在颅骨表面定点, 用牙钻打孔, 将同心圆单极刺激电极埋植到SFO, 坐标为: Bregma －0.85~－0.9 mm, 颅骨表面下4.85~5.35 mm(非SFO刺激组的电极埋植到4.15~4.55 mm)。电极外径为0.4 mm, 内芯尖端裸露250 μm。电极用牙科水泥固定于颅骨表面。(2)侧脑室埋套管:侧脑室定位坐标为Bregma －1.0 mm, L1.5 mm, 颅骨表面下3.5 mm, 埋入的套管外径为0.8 mm, 和SFO刺激电极一起用牙科水泥固定于颅骨表面。(3)术后训练:术后3 d内给动物肌注青霉素４万U/只。在恢复期5 d内, 每天08∶00~12∶00之间, 使大鼠熟悉实验操作过程8~10 min, 以减少应激影响。

1.2.2 实验操作(1)刺激SFO: 实验在08∶00~12∶00进行。动物在自由活动状态下, 通过埋植的电极对SFO进行电刺激。刺激方波为: 100μA,10 Hz,1 ms, 刺激5 min。观察刺激后出现饮水行为的动物数, 从各组动物的总数中计算出诱饮率, 并记录刺激后1 h内的饮水量(从刻度滴管读取)和饮水次数。(2)脑室注射阿托品: 在刺激SFO前10 min, 将套管内芯抽出, 插入微量注射针头进行注射, 注射速度为1 μl/1 min, 留针时间至少1 min。给药10 min后刺激SFO(参数同前), 并计算诱饮率、1 h内饮水量和饮水次数。阿托品(北京制药厂)用0.9%的生理盐水配置, 注射量为15 nmol/3 μl,对照组注射生理盐水的容量同阿托品注射组。

1.3 免疫组化(1)Fos免疫组化: 刺激SFO后1 h, 用过量麻醉处死大鼠, 开胸, 经左心室快速灌流0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)100 ml, 接着灌注4%多聚甲醛(PFA)100 ml。取全脑置于4% PFA中后固定6 h, 转入20%蔗糖过夜, 次日作连续冰冻切片(40~60 μm),参照脑图谱的核团范围, 每隔2张取1张切片, 放入PBS漂洗2次, 转入Fos抗体(兔抗鼠, 多克隆抗体, 浓度１∶3?000, 上海华美制剂公司)中孵育16 h, PBS漂洗2次后转入羊抗兔生物素化二抗IgG (1∶200, Vector公司)中1~2 h, PBS漂洗2次, 移入亲和素生物素试剂(avidin-biotin complex, ABC, 1∶200, Vector公司)1~2 h, 最后用0.05% DAB和0.02% H2O2显色。(2)双重染色: 选取刺激SFO组含有PVN和SON的切片,在Fos免疫组化操作至DAB显色后, 置于VP抗体(1∶1?000, 兔抗大鼠多克隆抗体, Instar公司)16 h, 经PBS漂洗2次,相继浸入二抗和ABC(1∶200, 0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制), 磷酸缓冲液漂洗2次后, 再用醋酸钠缓冲液漂洗1次,最后用加硫酸镍的DAB和0.03%H2O2显色, 终止显色反应后, 贴片风干, 经二甲苯透明处理后用树胶封片。在25×10光镜下观察, 细胞核呈棕褐色沉着的为Fos样免疫反应(Fos-like immunoreactivity, FLI)阳性神经元, 胞浆呈灰蓝色的为VP免疫反应阳性神经元, 计算每个核团中相同平面与视野内FLI阳性神经元数和VP免疫反应阳性神经元数,需要时摄片。

1.4 统计处理实验数据用mean±SE表示, 用SPSS统计软件包作ANOVA, 用Fisher′s Exact test 作诱饮率的比较, 用Excel97制成图表。

2结果

2.1 刺激SFO诱发的饮水行为

sFO刺激组的8只大鼠中有6只出现饮水行为, 诱饮率为75%, 平均1 h内饮水次数为1.25±1.09, 饮水量为0.28±0.22 ml。两个对照组无一出现饮水, 诱饮率为0, 平均1 h内饮水次数和饮水量均为0。将SFO刺激组和两个对照组(非SFO刺激组和假刺激组)相比较,诱饮率、饮水次数和饮水量都有显著差异(P＜0.01)。说明刺激SFO能诱发明显的饮水行为, SFO是一个和饮水有关的部位。

2.2 刺激SFO诱发的脑内Fos蛋白表达

刺激SFO使前脑8个脑区和后脑3个脑区的Fos蛋白明显表达。前脑8个部位是终板血管器官(OVLT)、正中视前核(MnPO)、室旁核(PVN)、视上核(SON)、下丘脑外侧区(LHA)、穹窿周核背侧区(pefd)、丘脑联合核(Re)和无名质(SI);后脑的3个部位是最后区(AP)、NST和LPBN。两个对照组的这些脑区或者没有或者只有很少量(0~10个)的FLI阳性神经元。SFO刺激组与这两个对照组相比,差别都非常明显(P＜0.01)。结果表明, 刺激SFO在诱发饮水行为的同时, 能激活脑内与饮水有关的一些核团。

2.3 刺激SFO激活PVN和SON神经元的化学性质

双染的实验结果显示, 刺激SFO诱发PVN和SON的FLI-阳性神经元中都有一部分同时呈VP免疫反应阳性。在PVN中这种共同表达Fos蛋白和VP的神经元占全部FLI-阳性神经元的(7.0±0.6)%,在SON则占到(20.8±2.0)%。

2.4 脑室注射阿托品对刺激SFO效应的影响

脑室注射阿托品后刺激SFO, 在14只动物中有5只出现饮水, 诱饮率为35.71%。而脑室注射生理盐水后刺激SFO, 在11只动物中有8只出现饮水,诱饮率为72.73%, 高于阿托品组。阿托品组平均1 h饮水次数为0.43±0.65, 饮水量为0.06±0.11 ml,明显少于对照组的饮水次数(1.09±0.94)和饮水量(0.27±0.25 ml)(P＜0.05)。 表明脑室注射阿托品能明显抑制刺激SFO所诱发的饮水行为。

在所观察的前、后脑11个部位中, 预先脑室注射阿托品可使刺激SFO诱导的Fos蛋白表达量减少, 除AP以外,都有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。实验结果表明, 阿托品在抑制饮水的同时, 能使刺激SFO诱导的绝大部分脑区的Fos蛋白表达明显减少。

3讨论

sFO是一个与饮水有关的重要脑区。由于它是一个缺乏血脑屏障的脑区, 并位于第三脑室上方[1,2],因此对外周和中枢的多种致渴刺激都能发生反应而诱发饮水行为[1,5~10]。外周注射、脑室注射、向SFO微量注射血管紧张素Ⅱ或氨甲酰胆碱都能诱发饮水[5,8,9,18]。近年来发现, sFO含有血管紧张素Ⅱ受体和M-胆碱受体[3~5]。所以一般认为, 上述这些致渴因子诱发饮水是作用于相应受体的神经元。本实验刺激SFO也能诱发明显的饮水行为,这与Smith刺激SFO能诱发饮水的实验结果[10]基本一致。看来, 电刺激很可能激活了SFO内多种神经元, 从而诱发饮水。

c-fos是即刻快速反应基因的一种, 能被多种刺激诱导而在神经元内表达。以往用c-fos技术研究中枢渴机制的文献表明,<