摘要：对原代培养7～9 d的海马神经元给予谷氨酸处理, 24 h后, 神经元的存活率降低。预先给予垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)能显著减少谷氨酸引起的海马神经元死亡。谷氨酸呈剂量依赖性增加海马神经元细胞内钙离子含量, PACAP能抑制谷氨酸引起的海马神经元细胞内钙离子浓度的升高, 特异性PACAP Ⅰ型受体拮抗剂PACAP 6-38能完全阻断PACAP减轻谷氨酸所致海马神经元损伤及降低谷氨酸所致神经元细胞内钙离子浓度升高的作用。提示PACAP能减轻谷氨酸引起的培养海马神经元的损伤, 该作用与PACAP抑制谷氨酸引起的海马神经元细胞内钙离子浓度升高有关, 是由PACAP Ⅰ型受体介导的。垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)是新近发现的一种脑肠肽, 由38个氨基酸残基组成, 与血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)高度同源, 是促胰液素/[高血糖素/VIP家族的新成员。PACAP及其受体广泛分布于中枢神经系统。以往的研究表明, PACAP可作为一种神经递质或神经调质, 在中枢和外周神经系统发挥作用。近来有研究提示, PACAP 38具有神经营养作用, 可促进神经细胞存活, 诱导神经细胞突起生长[1,2]。此外, PACAP还在神经系统的损伤中发挥保护作用。PACAP能减少脑缺血引起的海马神经元死亡数量, 具有减轻缺血性脑水肿的作用[3,4]。但是, PACAP在神经系统损伤中保护作用的机制尚不清楚, 本研究采用谷氨酸所致培养海马神经元损伤的模型, 初步探讨了PACAP保护作用的可能机制。

１材料和方法

1.1动物与试剂 新生SD大鼠由上海计划生育研究所提供; PACAP 38和PACAP Ⅰ型受体拮抗剂PACAP 6-38均为Peninsula公司的产品; Fura-2和F-127 购自Sigma公司。

1.2神经元的培养 取出生1 d的SD幼鼠, 无菌分离海马, 置于解离培养液D1-SGH (D1为无钙、镁离子的Puck液, SGH为蔗糖、葡萄糖和HEPES缓冲液)中。 剔除血管和脑膜, 剪成约1 mm３小块, 以0.125%胰酶于37℃消化25 min, 用含10%胎牛血清和10%马血清的DMEM(全培养液)中止消化, 反复吹打。将全培养液制备浓度为1×106/ml的细胞悬液接种于涂有0.1 mg/ml poly-L-lysine的96孔培养板中(每孔100 μl), 于37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后吸出全培养液, 换成单纯的B27无血清培养液, 以后每周换B27培养液2次。

1.3实验分组 培养7～9 d的海马神经元随机分为: (1）正常组: 单纯加入B27培养基; (2）谷氨酸组: 分别给予0.1、0.2、0.5和1 mmol/L谷氨酸; (3）PACAP＋谷氨酸组: 在加入谷氨酸前分别给予不同浓度的PACAP (1×10－７～1×10－13 mol/L）; (4）拮抗剂＋PACAP＋谷氨酸组: 在加入PACAP前分别加入10－10 mol/L PACAP 6-38, 其它处理同(3)组。

1.4细胞存活率的测定 终止培养前4 h加入10 μl 5.0 mg/ml MTT磷酸缓冲液(终浓度0.5 mg/ml）, 于5％ CO2 37℃培养箱中继续培养。4 h后加入10％SDS－0.01 mol/L HCl, 溶解生成的深蓝色结晶。在酶标仪(Bio-Rad Model 550）上读取光密度(测定波长为570 nm, 参照波长为630 nm）。

细胞存活率(％)＝OD值[]正常组OD值×100%.

1.5细胞钙离子浓度测定[5] 取出长有细胞的圆玻片, 用预热的Kreb′s-HEPES溶液冲洗3次。 放入含有pluronic F-127和Fura-2/AM(终浓度分别为0.04%和4 μmol/L）的Kreb′s-HEPES溶液中, 置于37℃的CO2孵育箱中30 min, 取出后用Kreb′s-HEPES溶液洗涤3次。将玻片固定在小室的底部, 加入200 μl的Kreb′s-HEPES溶液, 在显微镜下寻找细胞分散均匀、荧光标记良好的视野, 用于单细胞内[Ca2+]i水平的监测。

1.6数据处理 实验数据均用x±s表示, 采用F检验处理, P＜0.05为相差显著。

2结果

２.１谷氨酸对培养海马神经元的损伤作用

培养7～9 d的海马神经元给予谷氨酸处理24 h, 神经元存活率明显降低。50 μmol/L的谷氨酸可引起约50%的细胞死亡, 随着谷氨酸剂量的增加, 神经细胞的存活率逐渐降低, 当谷氨酸的剂量为1?000 μmol/L时, 细胞的存活率只有20%。

2.2PACAP对谷氨酸所至海马神经元损伤的保护作用

在加入200 μmol/L谷氨酸前30 min, 给予四种剂量的PACAP。当PACAP剂量为10－9、10－11及10－13 mol/L时, 神经元的存活率明显高于谷氨酸组(Ｐ＜0.01); 10－７ mol/L PACAP处理组神经元的存活率比谷氨酸组略有增加(P＞0.05)。另外, 在加入谷氨酸前30 min给予100 μmol/L MK-801(谷氨酸受体拮抗剂）, 作为阳性参照。

2. 3PACAP 6-38对PACAP减轻谷氨酸所致海马神经元损伤作用的影响

在给予PACAP (10－11 mol/L)前30 min, 给予PACAP 6-38 (10－10 mol/L), 与相应的PACAP组相比, 能明显降低神经元的存活率， 提示PACAP Ⅰ型受体拮抗剂PACAP 6-38可抑制PACAP减轻谷氨酸引起海马神经元损伤的作用。

2.4谷氨酸对海马神经元细胞内钙离子浓度的影响

加入谷氨酸可立刻引起海马神经元细胞内钙离子浓度的影响并迅速达到峰值。随后, 细胞内钙离子浓度逐渐降低, 但未恢复到基础值。海马神经元细胞内钙离子浓度的峰值, 随着谷氨酸浓度的增加而增加。

2.5PACAP对谷氨酸引起的神经元细胞内钙离子浓度升高的影响

预先5 min给予不同浓度的PACAP, 能不同程度地抑制500 μmol/L谷氨酸引起的细胞内钙离子浓度升高, 将各组钙离子浓度的峰值进行比较。当浓度PACAP为10－9、10－11、10－13 mol/L时, 细胞内钙离子浓度明显低于谷氨酸组, 具有统计学意义。单纯给予10－７ mol/L PACAP使海马神经元细胞内Ca2+含量迅速增加, 并恢复到基础值。单纯给予10－9、10－11、10－13 mol/L的PACAP不影响海马神经元细胞内Ca2+含量。

2.6PACAP 6-38对PACAP抑制谷氨酸引起海马神经元细胞内钙离子浓度升高的影响

在给予10－11 mol/L PACAP前5 min给予10－10 mol/L PACAP 6-38, 能抑制PACAP减轻谷氨酸所致海马神经元细胞内钙离子浓度升高的作用, 而单纯给予PACAP 6-38不能抑制谷氨酸引起的海马神经元细胞内钙离子浓度升高。此外, 单纯给予PACAP 6-38不影响海马神经元细胞内Ca2+含量。

3讨论

谷氨酸是哺乳动物脑内最主要的兴奋性氨基酸, 也是中枢神经系统兴奋性神经突触的主要神经递质。1969年, Olney等报道谷氨酸具有细胞毒性作用, 这一发现大大促进了对脑缺血损伤机制及其保护的研究。脑缺血时大量的谷氨酸被释放到细胞外, 作用于NMDA受体, 激活NMDA受体门控的Ca2+通道, 引起Ca2+过度内流, 激活多种钙依赖性酶, 引发一系列反应, 最终导致神经元损伤。本实验观察了PACAP对谷氨酸所致培养海马神经元损伤的保护作用, 结果表明PACAP能减轻谷氨酸引起的海马神经元损伤。细胞内钙离子失衡被认为是各种原因_鸬南赴鹕说摹肮餐贰盵6]。许多物质能减轻谷氨酸对神经元的损伤, 这与它们通过不同途径抑制钙离子内流, 稳定神经元细胞内钙离子浓度有关[7-8]。PACAP的神经保护作用是否也是通过稳定神经元细胞内钙离子浓度实现的,目前尚不清楚。

有研究表明, K＋也能明显增加神经元细胞内钙离子浓度, 但不引起神经元损伤[9]。神经元的损伤与钙离子进入细胞内的方式密切相关。谷氨酸增加神经元细胞内钙离子浓度, 主要是由于谷氨酸激活NMDA受体, 使细胞外的钙离子内流所致[10]。给予100 μmol/L谷氨酸可使神经元细胞内钙离子浓度迅速升高, 并随着谷氨酸剂量的增加而增加。我们在实验中还观察到, 神经元的死亡率和细胞内钙离子浓度均随着谷氨酸剂量的增加而增加。但是, 由于神经元死亡率与细胞内钙离子浓度的测定是分开进行的, 故难以将两者对应起来。有研究表明, 简单的线性关系不能反映神经元细胞内钙离子浓度与神经元死亡之间的关系。

预先5 min给予PACAP（10－9～10－13 mol/L）能抑制500 μmol/L谷氨酸引起的神经元细胞内钙离子浓度升高, 提示PACAP具有抑制谷氨酸引起的海马神经元细胞内钙离子浓度升高的作用。单纯给予PACAP不影响细胞内钙离子含量, 只是在浓度较高（10－７ mol/L）时, 才能使海马神经元细胞内Ca2+含量迅速增加, 并恢复到基础值。Tatsuno等[11]报道, 10－10 mol/L的PACAP就能使部分培养的海马神经元细胞内Ca2+浓度升高, 随着PACAP剂量的增加, 细胞内Ca2+浓度升高的神经元比例逐渐增加, 当PACAP的浓度为10－8 mol/L时, 达到峰值。Tatsuno等选取培养3 d的海马神经元进行实验, 而我们的实验对象为培养7～9 d的海马神经元。因此, 我们推测, 两者实验结果的差异可能是由于培养时间长短不同, 海马神经元成熟程度不同所致。PACAP增加细胞内Ca2+浓度, 可能是由于PACAP增加了细胞内钙的释放[12]。

目前, 已发现了至少两种PACAP受体亚型, 中枢神经系统以PACAP Ⅰ型受体为主, 而Ⅱ型受体主要分布在外周。本实验结果表明, 特异性PACAP Ⅰ型受体拮抗剂PACAP 6-38能阻断PACAP减轻谷氨酸所致海马神经元损伤的作用, 并能抑制PACAP降低谷氨酸所致神经元细胞内钙离子浓度升高的作用, 提示PACAP Ⅰ型受体介导了PACAP减轻谷氨酸致培养海马神经元损伤和抑制谷氨酸引起的海马神经元细胞内钙离子浓度升高的作用。PACAP与其Ⅰ型受体结合后, 通过G蛋白激活腺苷酸环化酶和磷脂酶C, 增加细胞内cAMP、IP3和DAG等的含量, 激活PKA和PKC。有研究表明, PKC的激活可影响NMDA受体的活动。PMA激活PKC后, 可以降低海马CA1区<