摘要：本工作观察了在超重(2G)环境中出生、 生存4个月后返回正常(1G)环境的Long-Evans大鼠运动行为的改变和恢复, 以及相关脑区Fos表达水平的变化,并与旋转刺激(重力变化的对照组)和去前庭传入大鼠相比较。 结果表明: 重力的变化导致实验大鼠静态和运动行为模式改变, 伸肌张力增加, 运动平衡、游泳定向和空中翻正的能力降低; 对1G环境再适应的时程因行为的不同而异, 其中游泳定向能力的恢复时间最长, 长于1个月。 旋转刺激只对运动行为有短暂的影响。 fos表达被认为是揭示参与应答感觉刺激而功能活跃脑区的有用工具。结果显示, 正常和毁迷路的对照大鼠的Fos呈低水平表达, 减重刺激使上、 下丘脑和围导水管灰质、中缝背核及孤束核的水平显著上调, 相反, 下橄榄、 蓝斑和前庭核团的Fos水平没有明显改变, 表明脑干对不同重力刺激存在不同的调控神经途径。在航空和航天过程中, 飞行人员常常处于明显的重力改变的环境中。重力的改变可诱发心血管、 骨骼、 前庭系统的生理机能改变, 其中对前庭系统的影响最为明显,后者可影响飞行员的飞行质量和安全[1~3]。重力改变对机体产生的影响及机体对重力改变的适应随着人类航天和航空事业的发展, 越来越多地得到人们的关注。

前庭感受器(迷路系统)的球囊和椭球囊中的耳石直接感受重力(线性加速度)的变化, 半规管主要感受头-颈部旋转(角加速度)的变化。毛细胞将这种变化的信息换能并传递到脑干的前庭核团。后者再传递到其它相关的脑区, 共同调控躯体的平衡、 头-眼反射和肌紧张[4,5]。重力对前庭系统机能的影响被分为超重(2G)和减重两种。 前者为超重条件对生活在正常环境(1G)中的动物和人机能的影响;后者为减重刺激对适应超重环境的机体返回1G环境时机能变化的影响。 近年来, 研究多集中在对超重的影响, 而对减重的影响研究较少[3],更缺乏对在超重环境出生、生长的动物返回1G后行为改变和再适应全过程的系统性研究。

为研究超重环境和减重刺激对前庭系统机能的影响和机体的再适应能力, 以及揭示参与机体调节减重反应的核团和脑区,本工作观察了在2G环境中出生长大的Long-Evans大鼠返回1G环境后的与前庭传入相关的一系列运动行为的改变和再适应的过程, 并观察了脑干中相关脑区Fos表达的变化(其它脑区和核团的变化由另文报告)。

１材料和方法

1.1动物及处理方法自制离心机, 在半径长54 cm的转臂远端下分别悬挂4个吊室, 逆时针方向转动。 在转速为360°/s时, 动物受到旋转和超重的刺激,吊室内动物对吊室底的压力为2.13 G (以下简称为2G)。 将另一个吊室贴近转动轴固定在转臂近端的上面, 制造接近1G的旋转环境,作为超重实验动物的对照组。每个吊室(40 cm×34 cm×32 cm)中放置受孕10 d的Long-Evans雌鼠1只。 其中一个吊室内装有摄像装置,监视动物行为。 除每天9∶00称体重、补充食物和水及3天1次打扫卫生外, 离心机始终旋转。 实验室温度为23±5℃, 吊室内光照∶黑暗=12∶12。用于运动和行为的观察动物(Long-Evans大鼠)分为3组: 超重(hypergravity rats, HR)组, 有13只大鼠(208~217 g)在2G中出生并生存4个月; 旋转(rotation rats, RR)组, 有8只1G条件旋转下出生并生存4个月的大鼠(241~256 g);正常(CR)组, 有7只正常条件下出生并生存4个月的大鼠 (在与吊室一样的笼具中养殖, 笼外有电扇吹风, 模拟离心机上吊室的环境, 247~260 g)。 用于Fos水平检测的动物也分为3组: hR组6只、CR组6只和损毁迷路组11只(作为刺激前庭感受器的对照组, 其中有6只在2G环境中出生并生存2个月后行两侧迷路损毁术,另5只在旋转环境中出生并生存2个月后行两侧迷路损毁术。 术后各自再返回原环境生存2个月, 待用。 后发现这两组动物的Fos水平相近, 统称IR组)做Fos水平检测。

用苯砷酸钠(sodium arsanilate)损毁前庭感受器。 动物用乙醚麻醉后, 穿过鼓膜向两侧中耳内注射对氨基苯砷酸钠[溶于生理盐水, 200 mg/ml, pH=7, 40 mg/(kg体重·每耳), 每日注射一只耳朵], 注射后保持耳向上体位20 min。对氨基苯砷酸钠破坏前庭内皮的分泌细胞和内耳的微环境, 会使前庭器官发生不可逆损伤。 此方法简便易行, 损毁程度彻底[6]。

long-Evans大鼠性情温和, 形体大小适中, 背部有黑白相间的花纹, 易于实验操作和观察。

1.2运动行为的观察用高速数字摄像记录系统(camera 3CDD digital video camcorder, CANON xL-1)和电视自动拍摄分析系统(E.L.I.T.E. system)[7] 分别以每秒25和100个画面记录和分析HR返回1G环境后的运动行为的改变和恢复,并与RR和CR动物相比较。 这些运动行为包括: 静态姿势、游泳、自由爬行、走转动横梁以及在步行机(Treadmill Simplex Ⅱ, france)上作的运动模式和空中翻正动作。

１.3检测Fos初级反应基因蛋白(primary response gene protein)水平6只CR, 返回1G环境后2 h的6只HR以及11只损毁前庭感受器鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 先后用100 ml生理盐水和4℃300 ml 4%多聚甲醛PBS溶液 (0.05 mol/L na2HPO4, 0.137 mol/L NaCl, pH 7.4) 自左心室灌流内固定。 取脑后在4℃的4% 多聚甲醛PBS溶液中作外固定。次日再移入4℃的30%的蔗糖PBS溶液中保存过夜。 在立体定位仪上作脑干横断切片, 切片厚30 μm[8], 用ABC法作Fos免疫组化检测[9]。于40和100倍光学显微镜下计算被标记的细胞。 每个核区计算5个主要相应切面。 主要试剂和Fos抗体是Sigma公司产品。

2结果

2.1站立姿势夸张

ＨR的肢体外张, 四足间面积扩大, 初始为41±8 cm2, 随大鼠对1G环境的适应逐渐减小, 15 d后达到正常水平(26±5 cm2); rR的站姿与CR的没有明显区别。

2.2自由运动活跃

hR在90 cm×90 cm平台上的自由运动状态与CR相比, HR在5 min内的爬行距离、运动速度、站立抬头探究次数均明显增加; 与CR的反应相反, 25 d后, HR并不因对该环境的熟习和适应而减少爬行距离和运动速度, 运动状态仍然活跃; RR动物不及HR活跃, 与CR情形相似。这一结果与在仓鼠上的观察结果相似[3]。

2.3游泳定向能力下降

入1G环境初期, HR (n=6) 在长和宽各90 cm、 水深40 cm的有机玻璃槽中游泳时, 不能保持身体的平衡和控制前进方向, 表现为身体下沉或翻滚, rR组 (n=5) 同样不能保持身体的平衡, 表现为身体多做前后翻滚和左右转动。 HR和RR找到位于入水点对侧的出水平台的时间分别是CR组 (n=5)的2.5和4.2倍, 后者平均用时是10±2.6 s。 1个月后, HR在水中的定向能力仍然明显低于CR组, 找到平台的时间是后者的1.8倍。 rR的定向能力恢复较快, 20 d后, 找到平台的时间为10±3.4 s。 空间的定向需要前庭、视觉和本体感受器的正常传入。视觉和本体感受器在水中定位中的作用相对减弱。 超重使大鼠前庭感受器对重力刺激的敏感性下降(见讨论), 这可能是造成其返回1G后定位困难的主要原因。

2.4走横梁平衡能力下降

转动横梁是检测动物平衡能力的好方法[7]。 圆柱型的转动横梁长1.8 m, 直径4.8 cm, 外缚麻布防滑, 高于地面1.2 m,马达控制横梁绕其纵轴做顺时针转动, 转速为216°/s。 每天20∶00~21∶00训练动物在转动横梁上单向走动并测试运动速度。 HR学习走转动横梁比CR困难,走横梁的步距小, 速度明显低于后者, 且经常跌下来; 初始, RR走转动横梁比HR还困难, 多拒绝直线运动, 而是原地随横梁转动, 直到跌下来。 10 d后, hR、 RR和CR走横梁的平均速度分别为0.8±0.4 m/s、 0.5±0.3 m/s和0.7±0.2 m/s, 可见, HR和RR走横梁的运动模式尚未固定。常用在圆筒上行走检测动物的平衡能力[3]。 走转动横梁要求动物有更高的平衡能力, 可更准确地反映动物运动机能的变化和恢复过程。

2.5固有步行模式改变

hR在步行机上行走, 踏板的转动速度从0.5 m/min开始, 分为5档, 逐渐调至13 m/min。 初始, HR的前后足高举, 2 d后趋于正常;但尾巴始终(超过25 d)高举, 上卷(10~40°)或平伸(0±5°); CR组的尾巴初始可上仰20±18°, 3 d后就一直呈下垂状(-10~－5°),与HR截然相反。 RR的运动模式与CR的相似。

２.6足迹印痕实验

观察HR和CR在30 cm×200 cm的白纸上行走时的足迹(前30 cm地面铺以蓝色染印纸), 初始, HR仅用少许足尖踏地, 继而足尖踏地面积加大, 20 d后运动足迹(全脚掌着地)逐渐与CR的相同。 RR足尖踏地状态与CR的相似。

2.7空中翻正反射能力降低

入1G环境初始, HR背部朝下从50 cm高处自由下落时, 很难完成空中翻正反射, 成功率是10%, 25 d后完成空中翻正反射的成功率达90 %,且头和背部的翻正时间分别从初始的0.12±0 s和0.20±0 s到25 d时的0.06±0.02 s和0.11±0.03 s, 与CR相同,后者分别为0.06±0.01 s和0.12±0.02 s。 初始, RR的空中翻正能力很低, 成功率仅达7%, 和HR一样, 身体在空中多次翻滚,落地常常头或背部先着地, 10 d后空中翻正反射的成功率达90%。

2.8相关脑区的Fos水平的变化

结果表明: 与CR组相比, HR组的Fos高表达区集中在中脑的上丘、下丘脑和围导水管的背外侧灰质, 而不在下橄榄核和前庭核团区域; 脑干中自主神经系统的核团,如三叉神经脊髓束核、孤束核表达水平提高; 单胺类神经递质的核团反应不一, 5-羟色胺能的中缝背核Fos水平明显上调, 而肾腺能的蓝斑的水平改变不明显;用苯砷酸钠损毁两侧的前庭迷路系统可阻断上述反应。

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