摘要：采用细胞培养方法, 以3H-TdR掺入率反映细胞增殖水平, 研究了白介素-2 (IL-2)对大鼠源的RC-4B/C垂体瘤细胞系增殖的影响,并初步分析了IL-2的作用机制。结果表明: (1) IL-2 (10～1000 U/ml) 剂量依赖性地显著提高RC-4B/C细胞3H-TdR掺入率。 (2)特异性酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制剂tyrphostin (1 μmol/L)可明显降低RC-4B/C细胞3H-TdR掺入率,并可部分阻断IL-2的促细胞增殖作用。 (3) 特异性蛋白激酶A (PKA)抑制剂H-9 (1 μmol/L) 作用后, 3H-TdR掺入率明显升高; h-9还可加强IL-2的促细胞增殖作用。 (4) 在本实验中未观察到抗雌激素tamoxifen (1 μmol/L)对IL-2促RC-4B/C细胞增殖效应有明显影响。上述结果表明, IL-2参与调节垂体瘤细胞的增殖活动, 并且IL-2的作用与PTK及PKA信号传导途径有关。白细胞介素-2 (IL-2) 是主要由辅助性T淋巴细胞分泌的含有 133个氨基酸残基的多肽。目前已知, IL-2的生理功能是在免疫系统内发挥调节效应,尤其是作为生长因子促进淋巴细胞的增殖与分化［1］。 近年来有作者报道, 人垂体瘤及啮齿类动物垂体瘤细胞系可以表达并分泌IL-2。用促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)或佛波酯(PMA)刺激后,可在小鼠源AtT-20垂体瘤细胞系中检测到IL-2 mRNA; 人促皮质激素垂体瘤细胞IL-2 mRNA的表达及IL-2的基础分泌均可以被PMA加强［2］。在人促皮质激素垂体瘤和AtT-20、 gH3细胞系上, 既检测到IL-2Rα mRNA, 也有成熟的IL-2Rα分布于细胞膜上［2, 3］。有人从AtT-20细胞中克隆出三个相互有重叠的IL-2Rβ cDNA, 测序结果与淋巴细胞中IL-2Rβ cDNA序列基本相同［4］。由于IL-2及其受体在垂体瘤中的存在, iL-2可能作为旁分泌或自分泌因子调节垂体瘤细胞的增殖与分化。1993年Arzt等报道, IL-2 (1～100 U/ml)显著提高GH3细胞系3H-TdR掺入率［3］。我室的研究显示, IL-2参与调节大鼠垂体前叶细胞的增殖活动,该调节活动受性激素等生理因素的影响［5］。本工作采用细胞培养方法, 研究IL-2对RC-4B/C垂体瘤细胞系增殖的影响, 并初步分析了IL-2的作用机制。

1材料和方法

1.1材料采用RC-4B/C垂体瘤细胞系(美国 ATCC), DMEM培养基和非必需氨基酸混合添加剂(美国GIBCO),新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所), 胰蛋白酶 (Difco), IL-2 (本校寄生虫教研室薛采芳教授惠赠), tyrphostin和tamoxifen(Sigma), H-9 (日本生化株式会社), 3H-TdR (上海原子核研究所), ZT-Ⅲ型微量细胞收集仪 (浙江绍兴东埔医疗仪器厂),以及L-50液闪计数仪(Backman)。

1.2RC-4B/C细胞系培养方法按照ATCC提供的程序复苏RC-4B/C细胞系, 将RC-4B/C细胞培养于混合培养基(DMEM 45%、 α-MEM45%、 小牛血清10%、 青霉素 100 U/ml、 链霉素100 U/ml、 7.425 mmol/L葡萄糖、 6.75 mmol/L HEPES、0.09 g/L BSA、 2.5 mg/L EGF和非必需氨基酸补充物), 置于37℃ 5% CO2的培养箱中。培养的RC-4B/C细胞为单层生长,每2～3d换液。传代时, 移去培养基, 加入新鲜配制的胰酶液体 (0.05% 胰酶, 0.9% NaCl, 0.02% EDTA和0.1% 葡萄糖),室温下培养约5～10 min至细胞分散。传代率为1∶2到1∶3。

1.33H-TdR掺入检查细胞生长良好后, 在传代时以无血清混合培养液轻柔冲洗2～3次,将RC-4B/C细胞以每孔1.2～1.5×105细胞的密度种植于96孔培养板。对照组每孔加入无血清混合培养液。 实验分10组, 每组分别加入1、 10、100、 1000 U/ml的IL-2, 以及tyrphostin (1 μmol/L)、 tyrphostin (1 μmol/L)+IL-2 (100 u/ml)、 H-9 (1 μmol/L)、 H-9 (1 μmol/L)+IL-2 (100 U/ml)、 tamoxifen (1 μmol/L)、 tamoxifen (1 μmol/L)+IL-2 (100 U/ml)。置于CO2孵箱中培养24 h后, 每孔分别加入0.37 MBq 3H-TdR,继续培养24 h。每孔加入2.5％的胰蛋白酶液20 μl及1 mmol/L EDTA液20 μl, 使两者终浓度分别为0.25%及0.1 mmol/L。10 min后, 用ZT-Ⅲ型微量细胞收集仪收集各培养孔里的细胞于G49型玻璃纤维滤纸上, 经烘干后, 移入液体闪烁计数瓶内。每瓶加入1 ml闪烁液(TP 4 g, poPop 0.1 g, 乙醇 20 ml, 二甲苯加至1000 ml), 而后进行液体闪烁计数, 确定cpm值。

1.4统计学处理将各实验组的3H-TdR掺入率cpm值换算为相应对照组cpm值均数的百分数。实验所得数据均以平均值标准差 (x±s)表示, 每组一般为5孔, 实验重复3次, 以t检验判断两组数值间差别的显著性。

2结果

2.1IL-2对RC-4B/C垂体瘤细胞系增殖的剂量效应

与正常对照组比较, IL-2 (10～1000 U/ml) 可剂量依赖性地提高RC-4B/C细胞3H-TdR掺入率,但其最高值可达到对照组的1.7倍左右。1 U/ml的IL-2对AP细胞3H-TdR掺入率没有明显影响(见图1)。

图1.IL-2对培养的RC-4B/C细胞增殖的影响

fig.1.Effect of IL-2 on 3H-TdR incorporation into RC-4B/C cells. Data are the mean±SD (n=5). *P＜0.05; **P＜0.01 compared with control.

2.2Tyrphostin对IL-2促RC-4B/C细胞增殖效应的影响

图2表示, 酪氨酸蛋白激酶(PTK)的特异性抑制剂tyrphostin (1 μmol/L)单独作用可显著性抑制RC-4B/C细胞的3H-TdR掺入率。提示RC-4B/C细胞的增殖活动与PTK信号传导途径密切相关。Tyrphostin(1 μmol/L)与IL-2 (100 U/ml)合用时, 与对照组比较, RC-4B/C细胞的3H-TdR掺入率没有明显变化, 但并不是tyrphostin与IL-2作用的简单的叠加;与IL-2组比较, 3H-TdR掺入率显著性降低。这表明, tyrphostin与IL-2的效应紧密相关, tyrphostin可以抑制IL-2的促增殖作用,因而IL-2的促RC-4B/C细胞增殖作用可能是通过PTK介导的。

图2.Tyrphostin对IL-2促进RC-4B/C细胞增殖效应的影响

fig.2.Effect of tyrphostin (T, 1 μmol/L) on the action of IL-2 (100 U/ml) on3H-TdR incorporation into RC-4B/C cells. Data are the mean±SD (n=5). *P＜0.05 compared with control.

图3.H-9对IL-2促进RC-4B/C细胞增殖效应的影响

fig.3.Effect of H-9 (1 μmol/L) on the action of IL-2 (100 U/ml) on 3H-TdR incorporation into RC-4B/C cells.Data are the mean±SD (n=5).*P＜0.05 compared with control; #P＜0.05 compared with IL-2 group.

2.3H-9对IL-2促RC-4B/C细胞增殖效应的影响

由图3可见, 特异性蛋白激酶A (PKA)抑制剂H-9 (1 μmol/L)单独作用可显著升高RC-4B/C细胞的3H-TdR掺入率,提示RC-4B/C细胞的增殖活动与PKA密切相关, PKA信号传导途径激活可能抑制RC-4B/C细胞增殖。H-9 (1 μmol/L)与IL-2 (100 u/ml)合用时, 与对照组比较, RC-4B/C细胞的3H-TdR掺入率显著升高; 与IL-2组比较, 3H-TdR掺入率显著升高,提示在对RC-4B/C细胞增殖调节过程中, H-9和IL-2之间有一定的相互增强作用。

2.4Tamoxifen对IL-2促RC-4B/C细胞增殖效应的影响

抗雌激素tamoxifen (1 μmol/L) 单独作用时, 对RC-4B/C细胞3H-TdR掺入率没有显著影响。Tamoxifen (1 μmol/L)与IL-2 (100 U/ml) 合用时, 与对照组比较, RC-4B/C细胞的3H-TdR掺入率显著升高; 但与单独IL-2 (100 U/ml)的作用相比, 两者没有显著差异(见图4)。这提示tamoxifen对IL-2调节RC-4B/C细胞增殖效应没有明显的影响。

图4.Tamoxifen对IL-2促进RC-4B/C细胞增殖效应的影响

fig.4.Effect of tamoxifen (Tam, 1 μmol/L) on the action of IL-2 (100 U/ml) on3H-TdR incorporation into RC-4B/C cells. Data are the mean±SD (n=5). *P＜0.05 compared with control.

3讨论

自从1976年 Morgen发现IL-2后, 人们对IL-2 的作用及其机制进行了详细的研究。IL-2的主要生理作用是刺激活化的T细胞克隆性生长,促进B细胞的增殖与分化等［1］。随着神经-内分泌-免疫网络概念的提出, 近十年来, IL-2对垂体及神经内分泌的作用日益受到重视。近来有人报道,人垂体瘤及啮齿类动物垂体瘤细胞系既可表达IL-2R, 又可分泌IL-2。如在小鼠源垂体瘤细胞系AtT-20细胞中检测到IL-2 mRNA;人促皮质激素垂体瘤既有IL-2 mRNA的表达, 也有一定的IL-2的基础分泌［2］。在人促皮质激素垂体瘤和AtT-20及GH3细胞系上, 既检测到IL-2Rα mRNA, 也有成熟的IL-2Rα分布于细胞膜上［2, 3］。有人从AtT-20细胞中克隆出IL-2Rβ cDNA序列［4］。由于IL-2及其受体在垂体瘤的存在,推测IL-2可能作为旁分泌或自分泌因子调节垂体细胞的增殖与分化。IL-2作为一种生长因子, 在免疫系统之外的多种非淋巴细胞上存在IL-2R,但普遍认为IL-2对它并不具生长刺激作用［6］。随着一些实验事实的出现, 这种观点很快受到挑战, 如IL-2促进大鼠和鸡胚交感神经轴突的生长［7］。有关报道及我室研究显示, IL-2对垂体瘤细胞和正常大鼠垂体前叶细胞增殖活动有明显的调控作用。

RC-4B/C垂体瘤细胞<