摘要：观察pp60c-src在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活中的作用, 以了解AngⅡ促VSMCs增殖的信号转导过程。将合成的反义c-src寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides, ODNs)以脂质体包裹转染培养的大鼠VSMCs, 用Western印迹测得细胞裂解液中pp60c-src含量明显下降, 免疫沉淀方法测得pp60c-src激酶活性仅为对照的14.4%, 而同时液闪测得MAPK活性无显著性变化(P＞0.05)。以AngⅡ刺激经转染反义ODNs 的低pp60c-src含量与激酶活性而MAPK活性无显著性变化的VSMCs后, 测得MAPK活性的增幅仅为对照的1.6%。由此可见, AngⅡ诱导VSMCs内MAPK的激活明显依赖于pp60c-src, 后者在VSMCs异常增殖中可能是一个重要的信号分子。血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)可通过激活血管平滑肌细胞(VSMCs)内磷脂酶C-γ1 (PLC-γ1)磷酸肌醇途径和Ras途径启动下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应, 从而转导促细胞增殖信号进入细胞核内［1～3］。由于AngⅡ受体缺乏内在激酶活性, 自AngⅡ受体至上述两条途径的信号转导过程一直是人们关注的热点。最近有研究报道, 具有蛋白激酶活性的pp60c-src可能介导了AngⅡ诱发的PLC-γ1磷酸肌醇途径和Ras途径的激活［1,4］。我们由此推测, pp60c-src在 AngⅡ 诱导 VSMCs 内 MAPK 激活及细胞增殖过程中可能是一个重要的信号分子。本研究用反义c-src寡脱氧核苷酸(oligodeo～xynucleotides, ODNs)转染培养的大鼠VSMCs抑制c-src基因表达, 再用AngⅡ刺激此种低c-src蛋白含量与激酶活性的模型细胞并测定MAPK的活性, 观察AngⅡ诱导VSMCs内MAPK激活是否依赖于c-src的激活及依赖程度。

1材料和方法

1.1试剂和仪器DMEM, Lipofectin和磷酸纤维素膜购自Gibco公司。抑蛋白酶肽, 亮抑蛋白酶肽和AngⅡ购自Sigma公司。Monoclonal antibody against pp60c-src (mAb 327)购自 Oncogene Science公司。Agarose conjugated polyclonal antibody against pp60c-src［pp60c-src(N-16)AC］ 购自Santa Cruz Biotechnology公司。goat anti-mouse IgG-HRP (1∶1000)购自华美生物工程公司。［γ-32p］ATP (比活度: ～185 TBq/mmol, 放射性比浓度: 0.37 GBq/ml) 购自北京亚辉生物医学工程公司。髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein, MBP) 购自Calbiochem公司。Genbank软件和激光光密度图像扫描仪为瑞士Pharmacia LKB公司产品。

1.2ODNs的设计与合成在c-src基因序列起始码区设计由16个碱基组成的反义ODNs。在其第1和第2个碱基之间, 第2和第3个碱基之间, 以及第14和第15个碱基之间, 第15和第16个碱基之间, 将硫原子取代磷酸基中的一个非桥性氧原子, 即进行嵌合体修饰。同时合成相应正义ODNs作为对照。ODNs由上海赛尔公司合成。正义ODNs: 5＇(AT)GGG CAG CAA CAA GAG C 3＇; 反义ODNs: 5＇GCT CTT GTT GCT GCC C 3＇。

1.3VSMCs的培养及处理雄性SD大鼠(150～250 g)由浙江大学医学院动物实验中心提供。应用贴块法将大鼠主动脉VSMCs原代培养于含20%小牛血清的DMEM培养液中(37℃,5% CO2)。使用第4～10代VSMCs, 以4×104/ml密度接种于Φ60 mm培养皿和12孔培养板内, 培养至次日汇合。换成含1%小牛血清的DMEM培养液, 血清饥饿68 h。用ODNs与lipofectin混合液［1∶1 (wt/wt)］转染VSMCs, 30℃, 4 h。再换成含20% 小牛血清的培养液, 常规培养20 h, 磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后以10－7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 5 min。用预冷的裂解缓冲液裂解细胞, 并离心收集上清, 用Folin酚法测定蛋白浓度。裂解缓冲液组成: 20 mmol/L Tris, pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 1%脱氧胆酸钠, 0.3% 十二烷基硫酸钠(SDS), 1 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L苯甲基磺酰氟, 10 μg/ml抑蛋白酶肽, 10 μg/ml亮抑蛋白酶肽。以PBS取代ODNs与lipofectin混合液作为Basal组。

1.4Western印迹测定pp60c-src含量取等浓度的细胞裂解液, 按每孔10 μg蛋白量, 以9% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。经转膜及封闭后, 将膜移入含mAb 327的一抗反应液中(1 μg/ml) 4℃过夜。洗膜后, 移入含goat anti-mouse IgG-HRP的二抗反应液中室温缓摇2 h。洗膜后, 浸入增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence, ECL)室温1 min。X光胶片曝光后,在激光光密度图像扫描仪上扫描得光密度值。

1.5pp60c-src免疫沉淀和自身磷酸化率测定取300 μg蛋白量的细胞裂解液, 加pp60c-src(N-16)AC 5 μl, 4℃旋摇过夜。沉淀并洗涤后重悬于激酶反应液中(20 mmol/L PIPES, pH 7.0, 10 mmol/L MnCl2, 50 μmol/L ATP, ［γ-32p］ ATP0.37 MBq)终体积50 μl, 30℃, 10 min。反应产物以9% SDS-PAGE分离, 湿胶直接放射自显影, 将X光片在激光光密度图像扫描仪上扫描得光密度值。

1.6MAPK的酶活性测定取等浓度的细胞裂解液30 μl, 加入4×激酶反应缓冲液10 μl (80 mmol/L HEPES, pH 7.2, 2 mmol/L Na3VO4, 8 mmol/L 二硫基苏糖醇, 40 mmol/L MgCl2, 0.4 mg/ml 牛血清白蛋白), 及MAPK的特异性底物MBP 1mg/ml、ATP 0.05 mmol/L和［γ-32p］ATP 74 kBq进行激酶反应, 30℃, 20 min。将反应产物点样于磷酸纤维素膜上, 用75 mmol/L磷酸洗膜, 干燥后将各膜片进行液闪计数。

1.7统计学处理结果以( ±s)表示, 两组间比较采用t检验。

2结果

2.1转染不同浓度反义c-src ODNs对VSMCs内pp60c-src含量的影响

Western印迹表明, VSMCs内pp60c-src含量分别在0.2、0.5、1.0、2.0 μmol/L四种转染的ODNs浓度情况下, 反义较正义减少了31.8%、65.3%、69.7%、84.2%, 呈浓度依赖性下降(图1)。

2.2AngⅡ刺激对转染反义c-src ODNs的VSMCs内pp60c-src激酶活性和含量的影响

细胞裂解液经免疫沉淀pp60c-src后测定自身磷酸化率, 即反映其激酶活性。结果表明, (1) 在Basal组, 用AngⅡ刺激VSMCs可使pp60c-src激酶活

1.转染不同浓度反义c-src ODNs对VSMCs内pp60c-src蛋白含量的影响

Fig.1.Effect of different concentrations of transfected antisense c-src ODNs on the contents of pp60c-src in VSMCs.

2.AngⅡ对转染反义c-src ODNs (2 μmol/L)的VSMCs内pp60c-src激酶活性的影响

Fig.2.Effect of Ang Ⅱ on the kinase activity of pp60c-src in VSMCs transfected by antisense c-src ODNs (2 μmol/L).

为排除pp60c-src含量对其激酶活性可能有的影响, 实验同时测定上述各样本中pp60c-src的含量。Western印迹显示, 无论是Basal组或转染正义/反义ODNs组, pp60c-src含量均不受AngⅡ短暂刺激的影响(P＞0.05), 即AngⅡ诱导pp60c-src激酶活性的增高可以排除是由pp60c-src含量增高所致的可能性(图3)。

3.AngⅡ对转染反义c-src ODNs (2 μmol/L)的VSMCs内pp60c-src蛋白含量的影响

Fig. 3.Effect of Ang Ⅱ on the contents of pp60c-src in VSMCs transfected by antisense c-src ODNs (2 μmol/L).

2.3AngⅡ刺激对转染反义c-src ODNs的VSMCs内MAPK活性的影响

实验结果显示: (1) 在用AngⅡ刺激后, Basal组和正义ODNs组MAPK活性均增加了10.6倍, 而反义ODNs组MAPK活性仅增加了0.17倍。即AngⅡ刺激转染反义ODNs组的VSMCs后, 其MAPK活性的增幅仅为对照的1.6%。 (2) 在不用AngⅡ刺激的情况下(control), 无论转染正义/反义ODNs, MAPK活性无显著性差异(P＞0.05)。

3讨论

AngⅡ可诱导VSMCs内MAPK磷酸化而激活［5］, 本研究用AngⅡ刺激培养的大鼠VSMCs 5 min, 即测得MAPK活性增加了10.6倍。这进一步证实, MAPK对介导VSMCs增殖作用是肯定的, 但从AngⅡ作用于其受体到MAPK活性增加的细胞内信号转导过程尚不完全清楚［6］。

有研究报道, AngⅡ诱导VSMCs内MAPKKK(Raf)-MAPKK-MAPK级联反应是通过两条途径激活Raf的［7］。一条是与经典的G蛋白耦联受体信号转导相似的途径: 受体通过某种方式激活PLC-γ1, 后者再通过磷酸肌醇途径使Raf分子上的Ser499磷酸化而使其激活［1］。另一条途径与酶蛋白受体信号转导过程相似: AngⅡ诱导VSMCs膜上血小板源性生长因子(platelet- derived growth factor, PDGF)受体酪氨酸磷酸化［2］, src同源域胶原蛋白(Shc)酪氨酸磷酸化增加, 并与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)和鸟苷酸交换因子(Sos)形成复合物(Shc-Grb2-Sos)激活Ras (p21c-ras), Ras可征募Raf到细胞膜上, 并使其磷酸化而激活［3］。AngⅡ不论是通过上述哪条途径激活MAPK级联反应, 因其G蛋白耦联受体缺乏内在激酶活性, 它不可能直接使PLC-γ1、Shc和Ras-GAP酪氨酸磷酸化而激活。进一步研究发现, 一种典型的非受体蛋白酪氨酸激酶pp60c-src可能介导了它们的酪氨酸磷酸化［1,4］。pp60c-src是由原癌基因src编码的一个分子量为60 kD的磷蛋白(pp60c-src), 其自身酪氨酸磷酸化对于pp60c-src的激酶活性是必需的