摘要：运用Fos免疫组织化学、 NADPH-d组织化学、 Fos/NADPH-d双标、 鞘内注射和反义寡核苷酸技术,观察吗啡戒断大鼠脊髓神经元活动变化及NO在其中的作用。结果发现: 非吗啡依赖大鼠急性应用纳洛酮和吗啡依赖大鼠脊髓水平Fos-LI和NADPH-d阳性神经元表达与对照组相比无明显变化,二者也无Fos/NADPH-d双标神经元表达; 吗啡依赖纳洛酮催促戒断大鼠脊髓Fos-LI、 NADPH-d阳性神经元、 纤维和终末表达明显增加, 且出现Fos/NADPH-d双标神经元表达。Fos-LI和Fos/NADPH-d双标神经元呈现双侧脊髓全层分布, nADPH-d阳性神经元、 纤维和终末主要位于双侧脊髓背角浅层。鞘内注射NOS抑制剂L-NA和nNOS反义寡核苷酸均明显降低吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断症状评分,减少吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI表达。上述结果提示: NO参与介导吗啡戒断大鼠脊髓神经元敏感化。吗啡戒断指反复使用吗啡后造成的一种身体适应状态, 一旦停药或使用阿片类药物拮抗剂(如纳洛酮),将引发一系列的生理功能紊乱即戒断综合征。蓝斑核是参与介导吗啡戒断的重要结构; 细胞内cAMP通路超射性(overshoot)上调是诱发吗啡戒断的生化基础。越来越多的资料显示,脊髓也参与介导吗啡戒断反应, 而NO/cGMP信号转导通路在吗啡依赖和戒断中也发挥重要作用[1~3]。有研究表明, 当予以纳洛酮催促戒断后,吗啡依赖大鼠脊髓神经元表现出一种高兴奋的敏感状态, 从而介导吗啡戒断反应[4，5]。本实验旨在运用Fos免疫组织化学、NADPH-d组织化学、Fos/NADPH-d双标、鞘内注射和反义寡核苷酸技术,从形态学上观察吗啡戒断大鼠脊髓神经元活动变化及NO在其中的作用。

雄性SD大鼠(200~250 g), 由徐州医学院实验动物中心提供。盐酸吗啡由青海制药厂生产; 纳洛酮由北京四环制药厂生产; β-NADPH黄递酶和氮蓝四唑(NBT)为Sigma公司产品。兔Fos多克隆抗体、ABC试剂盒和DAB为Vector公司产品。NOS反义寡核苷酸由上海生物工程公司合成; lipofectinAMINE购自GibcoBRL公司。其他试剂至少为分析纯。

大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠, 麻醉后在枕骨大孔上方纵向切开一约1.5~2.0 cm切口, 暴露枕骨大孔, 将已经消毒的一端缠有米粒大小parafilm小结、另一端火烧封口并充满生理盐水的PE-10导管缓慢插入鞘内至脊髓胸腰段(插入深度5.5~6.0 cm)。导管插入后, 将小结直接缝在肌肉上或缝埋在肌肉下。 待动物清醒后, 剔除肢体瘫痪的动物, 用利多卡因实验确定导管在鞘内。术后常规使用抗菌素,分笼单独饲养5~7 d后即可用于实验。

所有正常大鼠被分为两组, 分别皮下注射吗啡和生理盐水, 吗啡首日注射10 mg/kg, 每日2次, 隔日每次增加10 mg/kg, 至第6天末次注射50 mg/kg, 建立吗啡依赖模型; 生理盐水组注射同体积的生理盐水。末次注射后约4 h, 每组再分成两个亚组, 分别腹腔注射纳洛酮4 mg/kg或同体积生理盐水,建立吗啡戒断模型。这样, 全部大鼠按皮下和腹腔注射被分为四组, 即生理盐水-生理盐水组(sal-sal, n=4)即生理盐水组, 生理盐水-纳洛酮组(sal-nal, n=4)即纳洛酮组, 吗啡-生理盐水组(mor-sal, n=4)即吗啡依赖组, 吗啡-纳洛酮组(mor-nal, n=6) 即吗啡戒断组。鞘内埋管成功大鼠按上述方法建立吗啡依赖和戒断模型, 在纳洛酮激发戒断前10 min, 鞘内注射100 μg的L-NA(溶于20 μl的生理盐水中),此组为L-NA组(n=5); 在纳洛酮激发戒断前24 h和12 h分别鞘内注射0.3 nmol脑型NOS (nNOS)反义寡核苷酸、nNOS有义寡核苷酸(均溶于20μl 20% LipofectinAMINE)和等容的20% LipofectinAMINE, 此三组分别为脑型反义组(n=5),脑型有义组(n=4)和戒断对照组(n=4)。

在纳洛酮激发戒断后的1 h内,根据湿狗样抖动、异常姿势、激惹症状、咬牙、植物神经系统症状及体重降低等进行戒断症状评分。nNOS特异性的反义寡核苷酸根据基因结构, 针对翻译起始密码ATG的-11到+7的碱基设计反义寡核苷酸的序列为5′-CTT cCA TGG TAT CTG TGT-3′, 有义寡核苷酸的序列为5′-ACA CAG ATA CCA TGG AAG-3′。

fos免疫组织化学在纳洛酮激发戒断1 h后, 大鼠被麻醉、灌注、固定、取材(脊髓胸腰段)、切片[6]。切片用PBS清洗后, 在5%正常羊血清中加0.3% triton X-100, 室温孵育30 min, 然后在Fos一抗(1∶1?000) 4℃孵育48 h; 用PBS洗去未结合的一抗, 加入生物素标记羊抗兔IgG(二抗)(1∶200), 37℃孵育1 h; PBS洗去未结合的二抗, 加入亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(1∶100), 37℃孵育2 h;切片充分清洗后, 用0.05% DAB加0.003% 双氧水显色5~10 min, 用蒸馏水终止反应; 最后将切片转到涂有明胶的玻片上, 风干、 脱水、 透明、封片。

nADPH-d组织化学切片用PBS清洗后, 在含有0.3% Triton X-100、 0.6 mg/ml β-NADPH和0.5 mg/ml NBT的PB液(pH8.0)中37℃孵育40~60 min, PBS终止反应。

fos/NADPH-d双标切片先进行NADPH-d组织化学处理, 用PBS清洗后再行Fos免疫组织化学研究, 其他步_柰稀?

对每只大鼠选择5张阳性神经元最多的切片[7,8], 并记录每张切片上阳性神经元数目的总和,对所有记数的阳性神经元均不考虑其染色深浅度。采用单因素方差分析比较各组间数据差异的显著性。数据用均数±标准差表示。

主要实验结果如下:

1．吗啡戒断大鼠脊髓Fos、NADPH-d和Fos/NADPH-d 双标神经元表达变化

生理盐水组、纳洛酮组和吗啡依赖组均有少量Fos-LI阳性神经元表达, 主要位于脊髓背角浅层; 纳洛酮组表达量略高于生理盐水组和吗啡依赖组,但无统计学意义(P＞0.05); 吗啡戒断组Fos-LI阳性神经元表达明显增加(P＜0.0001), Fos-LI阳性细胞分布无明显特征,呈两侧全层密集分布(表1)。

生理盐水组、纳洛酮组和吗啡依赖组NADPH-d阳性神经元、纤维和终末表达无明显差别(P＞0.05), 吗啡戒断组NADPH-d阳性神经元、纤维和终末表达明显增加(P＜0.01),以脊髓背角浅层增加最为明显(表1)。

生理盐水组、纳洛酮组和吗啡依赖组均无双标神经元表达; 吗啡戒断组则出现Fos/NADPH-d双标神经元, 主要分布在脊髓背角浅层, 其他区域也有较多分布。

2.鞘内注射NOS抑制剂、NOS反义寡核苷酸对大鼠吗啡戒断症状评分的影响

鞘内注射NOS抑制剂L-NA和nNOS反义寡核苷酸均明显降低吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断症状评分, nNOS有义寡核苷酸对吗啡戒断症状评分无影响。

3.鞘内注射NOS抑制剂、NOS反义寡核苷酸对吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI表达的影响

鞘内注射NOS抑制剂L-NA、nNOS反义寡核苷酸明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI表达, nNOS有义寡核苷酸对吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI表达无影响。

本实验中, 吗啡戒断大鼠脊髓出现大量Fos-LI阳性细胞, 且其分布呈现双侧全层性, 提示吗啡戒断时, 脊髓有大量神经元处于高兴奋状态(敏感化),这一高兴奋状态可能是参与介导吗啡戒断的反应。

传统观点认为, 慢性使用吗啡引起细胞内cAMP信号转导通路适应性上调, 吗啡戒断时这一通路呈超射样改变, 是造成吗啡依赖和戒断的生化基础。在脊髓中,阿片受体主要分布在初级传入终末及其投射神经元和背角浅层中间神经元[9]。吗啡戒断时, 这些神经元细胞内的cAMP含量明显增加, cAMP与PKA的调节亚基结合使其催化亚基释放并转位进入核内。 pKA的催化亚基在核内可使CREB (cAMP-responsible element binding protein) 的ser-133位点磷酸化, 磷酸化的CREB可诱导c-fos基因表达。此观点能很好地解释吗啡戒断时脊髓背角浅层Fos-LI阳性细胞表达,但不足以解释脊髓其他无阿片受体分布区域的Fos-LI阳性细胞表达变化。

本实验中, 吗啡戒断时脊髓背角浅层NADPH-d阳性神经元、纤维和终末表达明显增加, 且背角浅层和其他区域出现Fos/NADPH-d双标神经元表达,提示NO在吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI阳性细胞表达变化中发挥重要作用。鞘内注射NOS抑制剂和NOS反义寡核苷酸明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI表达进一步证实了这一观点。我们认为,吗啡戒断时, 背角浅层存在阿片受体的神经元胞体内cAMP含量显著增加, cAMP含量增加一方面可与PKA的调节亚基结合,使其催化亚基释放并转位进入核内。PKA的催化亚基在核内可使CREB的ser-133位点磷酸化, 磷酸化的CREB可与c-fos基因的CRE结合, 从而调控c-fos基因表达。另一方面,可通过胞内信号转导系统之间的交叉作用(cross talk), 如通过影响电压门控钙通道促进Ca2+跨膜内流; 通过激活PKA使IP3R磷酸化而增加Ca2+浓度;直接激活CaM等, 增加细胞内Ca2+浓度, 从而激活NOS, 生成NO[7]。NO可弥散至邻近细胞和脊髓其他区域,激活这些细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶(GC), 使cGMP含量增加, 从而激活胞内蛋白激酶系统, 使细胞兴奋并诱导Fos表达。

nO在吗啡耐受、依赖和戒断中的作用已被大量实验所证实[10,11]。实验中, 吗啡戒断时脊髓背角浅层NADPH-d阳性神经元、纤维和终末表达明显增加, 鞘内注射NOS抑制剂、nNOS反义寡核苷酸能明显抑制脊髓水平Fos表达和吗啡戒断症状,而注射nNOS有义寡核苷酸无效, 提示吗啡戒断过程中NOS活性和nNOS基因表达增加。Machelska等[12]利用原位杂交和免疫组织化学的方法,也证实慢性吗啡处理大鼠的脊髓NOS mRNA表达水平增加。慢性吗啡处理导致的NOS基因表达增加为戒断过程中NOS的高活性提供了基础,而纳洛酮催促戒断使其高活性得以体现, 从而使NO大量产生, 兴奋脊髓神经元并诱导Fos表达, 进而介导了吗啡戒断反应。

参考文献

[1]Hayward MD, Duman RS, Nestler EJ. Induction of the c-fos prot