摘要：L在单个大鼠肾上腺嗜铬细胞上, 用显微荧光测量和碳纤电极记录方法, 测量可激活毒蕈碱(muscarine, M)受体的激动剂乙酰甲胆碱(methacholine, MCh)对胞内游离钙浓度［Ca²⁺］_i和儿茶酚胺激素分泌的影响。在细胞外液含2 mmol/L Ca²⁺时, 用含钙或不含钙的MCh (1 mmol/L) 刺激细胞, 均引起［Ca²⁺］_i 的升高或钙振荡, 并诱发激素的分泌。细胞外液不含Ca²⁺时, 以类似方式施加MCh刺激也引起［Ca²⁺］_i的升高和激素分泌。 这些资料表明, 激发嗜铬细胞毒蕈碱受体可引起钙库释放, 并触发分泌。在无外钙条件下, 还研究了连续刺激引起的［Ca²⁺］_i 变化, 发现第一次的1 mmol/L MCh刺激可升高［Ca²⁺］_i, 但与细胞外液中含Ca²⁺时不同的是, 细胞对随后的MCh刺激不再响应。这表明, 在无外Ca²⁺时, 细胞内Ca²⁺库可以被单次MCh刺激所排空。

肾上腺嗜铬细胞是分泌激素肾上腺素和去甲肾上腺素的内分泌细胞。交感神经元释放的乙酰胆碱是肾上腺嗜铬细胞的生理刺激物, 可以同时激发烟碱型(N型)和毒蕈碱型(M型)两种受体。通过胞外钙内流(N型受体介导)和胞内钙库释放(M型受体介导)两种途径均可导致细胞内钙离子浓度的升高。其中, 毒蕈碱受体的激发既可调制膜离子通道, 例如内向阳离子通道和钙依赖性钾离子通道的活动^［1～3］, 也可诱导三磷酸肌醇(IP₃)的产生, 以释放胞内钙库的Ca^{2+［4～6］}。 由于神经和嗜铬细胞分泌递质或激素强烈依赖于细胞内自由Ca²⁺ 浓度(［Ca²⁺］_i)的升高^［7］, 因而N型和M型受体导致的［Ca²⁺］_i升高可能都对递质分泌有所作用。通过腺体灌流和细胞种群试验, 已知不同动物来源的嗜铬细胞钙库对分泌作用不同, 具有种间差异^{［1～3, 6］}。90年代问世的微碳纤电极(carbon fiber electrode, CFE)记录技术, 可对单个细胞上的分泌情况实时地进行电化学检测^［8～10］。CFE结合膜片箝等方法, 在单个嗜铬细胞上可以研究不同钙库激动剂对分泌的调控作用。

我们以前的工作已经阐明了N型受体介导的外钙内流在细胞分泌中的重要作用^［10］。但这种细胞上M型受体介导的胞内钙库释放的Ca²⁺对分泌的意义, 尚不很清楚。本研究采用显微荧光测量和碳纤电极记录方法, 在单个大鼠嗜铬细胞上研究了毒蕈碱受体激动剂MCh对钙库释放和激素分泌的作用。

1材料与方法

1.1试剂标准细胞外液组成(mmol/L): NaCl 140, KCl 2.8, MgCl₂ 1, CaCl₂ 2, HEPES 10, 葡萄糖 10; pH 7.2。 无钙细胞外液与标准细胞外液基本相同, 只是由等量Mg²⁺取代标准液中的Ca²⁺, 并加0.5 mmol/L EGTA。 胶原酶Ⅰ、 透明质酸酶、 DNase Ⅰ、 多聚赖氨酸、 MCh、 muscarine、 HEPES和EGTA为Sigma产品。DMEM、 胎牛血清为Gibco产品, 其他试剂为国产分析纯。

1.2细胞制备培养方法详见我室以前发表的文献^［11］。摘要如下: 体重150～250 g的雄性Wistar 大鼠以乙醚麻醉后颈椎脱臼处死。 取肾上腺, 剪除被膜及皮质, 将髓质剪成小块, 在3‰胶原酶Ⅰ、 2.4‰透明质酸酶、 0.2‰ DNase Ⅰ的混合酶液中37℃下消化约50 min。细胞经离心收集, 滴加在预涂有多聚赖氨酸的盖玻片上, 加90% DMEM与10% 胎牛血清培养基在37℃进行原代培养^［11］。实验使用培养2～6 d的细胞。

1.3显微荧光测量方法将培养细胞的培养基换为标准胞外液, 加入酯化的Ca²⁺荧光探针Fura-2/AM至终浓度4 μmol/L, 在37℃ 孵育40 min, 再以胞外液冲洗2～3次, 装入内盛1 ml胞外液的测量皿(直径35 mm)中, 避光放置约5 min后在Zeiss Axiovert 100 荧光显微镜上以345/380 nm的双波长法测量单细胞中与胞内游离钙浓度(［Ca²⁺］_i) 有关的比值F345/F380^［12］。采样速率除指明外, 一般为1 Hz。 如为无外钙条件下实验, 则培养皿中胞外液去除Ca²⁺, 含0.5 mmol/L EGTA, 并将MgCl₂ 增至2.5 mmol/L, 以保持溶液渗透压不变。实验在23±2℃下进行。

由于实验中采用酯化的Fura-2/AM, 我们曾经发现进入胞内的部分Fura-2因隔室效应(compartment)而对胞浆内Ca²⁺不敏感^［15］, 所以本文未对Fura-2定标。 Fura-2信号放大器输出的信号带宽为3 kHz, EPC-9对fura-2信号的采样频率仅2 Hz, 因此原始记录中的快速变化(＞＞2 Hz)成分为白噪声, 而不是信号。为了避免将白噪声误认为信号, 图1～3的部分记录线用粗笔做了加宽。

1.4碳纤电极(carbon fiber electrode, CFE)记录方法按我室前文的报道制作CFE^［9,17］。 采用聚丙烯材料组成的微量取液器吸头(10 μl)(Gilson, 法国), 套入长约1.5 cm、 直径7 μm的碳纤丝(Courtald Ltd,英国)。加热并水平牵拉, 在碳纤丝表面形成聚丙烯绝缘薄层。从碳纤丝裸露处切断即成。使用前, 由电极末端充灌4 mol/L NaCl。

将嗜铬细胞用标准胞外液冲洗3次后装入内盛2 ml胞外液的测量皿(直径35 mm)。无外钙条件下实验时,细胞放置在无钙胞外液内。检测时CFE尖端与细胞表面轻微接触,由EPC-9膜片箝放大器(HEKA Electronics,德国)对电极施加780 mV直流电压。电极附近的局部细胞膜区域中分泌的儿茶酚胺分子扩散至电极尖端时,被电极氧化并产生电流信号^［8～10］。电流信号经低通滤波(1kHz)后被EPC-9放大采样并存储。采样频率为2kHz。

1.5乙酰甲胆碱(MCh)的施加在PP-83电极拉制器(Narishige,日本)上拉制出孔径5 μm 的玻璃微管, 以标准胞外液或无钙胞外液配制的MCh溶液充灌。刺激时, 以MX-1微操纵器(Narishige, 日本)将此加药微管孔口移至细胞附近约30 μm处, 对微管内施加正向气压。每次向细胞加药时间10 s左右。无论是钙测量或分泌实验, 为比较细胞内Ca²⁺库分别使用了标准胞外液和无钙胞外液。加药管也分含钙和不含钙两种。

2结果

2.1标准胞外液中MCh的升钙作用

在标准胞外液中, 以含钙0.1, 1, 和10 mmol/LMCh刺激时, 可使所有被测嗜铬细胞胞内F345/F380信号上升, 对应于游离钙离子浓度(［Ca²⁺］_i) 的升高。 图1a显示1 mmol/L引起的［Ca²⁺］_i信号(n=12)。约有2/3的细胞呈现钙浓度的反复升降, 即钙振荡(calcium oscillation, 见图1b)。在标准胞外液中, 使用无钙的MCh刺激也能引起［Ca²⁺］_i 升高(图1C, n=9)。但一般没有胞内钙振荡。

图1大鼠嗜铬细胞在标准含钙胞外液中施加1 mmol/L MCh对［Ca²⁺］_i 的影响

Fig.1Effects of 1 mmol/L methacholine on ［Ca²⁺］_i of rat chromaffin cells in standard extracellular solution

a． Elevation of ［Ca²⁺］_i by the stimulation solution containing Ca²⁺. b． Calcium oscillation. c． Elevation of ［Ca²⁺］_i by the stimulation solution lacking Ca²⁺. The F345/F380 traces were smoothed by bold pen to neglect fast noise.

图2无钙胞外液中1 mmol/L MCh诱导的［Ca²⁺］_i 升高

fig.2Elevation of ［Ca²⁺］_i induced by 1 mmol/L MCh in Ca²⁺-free extracellular solution

a． 2 mmol/L Ca²⁺ in stimulation solution.b. 0 Ca²⁺ in the stimulation solution.

图3无钙胞外液中反复施加1 mmol/L MCh诱发的［Ca²⁺］_i 的变化

Fig.3Changes in ［Ca²⁺］_i induced by suc～ces～sive 1 mmol/L MCh appli～cations for Ca²⁺-free extra～cellular solution

The stimulation solution contains no Ca²⁺ for the first three times, but 2 mmol/L Ca²⁺ for the fourth.

2.2无钙胞外液中MCh的升钙作用