摘要：本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)角度, 研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标, 以凝胶内MBP原位磷酸化测定MAPK活性, 以免疫印迹法(Western boltting)分别测定MKP-1及磷酸化p44MAPK、p42MAPK蛋白表达。结果发现: (1)AngⅡ(10－７ mol/L)处理48 h, 心肌细胞 3H-亮氨酸掺入率、蛋白含量及细胞表面积明显增加, AngⅡ增加 3H-亮氨酸掺入的作用可被血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)拮抗剂CV11974(10－6 mol/L)明显抑制(抑制85%), 被MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(5×10－5 mol/L)部分抑制(抑制32.5%); (2) CV11974或PD098059可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达及MAPK酶活性(以γ-32P-ATP掺入表示); (3)以磷酸化MAPK蛋白表达反映MAPK活性, 可见AngⅡ处理心肌细胞 5 min, MAPK活性即开始增加, 30 min左右达到高峰, 2 h后基本恢复正常; 而MKP-1蛋白表达30 min即见增加, 持续2 h以上; (4) 用放线菌素D (actinomycin D)处理心肌细胞30 min可明显抑制MKP-1的表达, 同时使AngⅡ致磷酸化MAPK蛋白表达时间延长至2 h以上。以上结果表明, MAPK激活在AngⅡ导致的心肌肥大反应中具有重要作用, MKP-1通过使活化的MAPK去磷酸化而使MAPK失活, 从而参与对心肌肥大反应的调节。许多研究证明, 在压力超负荷等病理因素所导致的心肌肥大反应中, 血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是重要的刺激因子, 而血管紧张素转化酶抑制剂及AT1受体拮抗剂是目前治疗高血压心肌肥厚的重要药物[1,2]。但对AngⅡ导致心肌肥大反应的细胞内信号调控机制尚未完全阐明。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是目前发现的最主要的一个生长信号调节蛋白, 广泛分布在细胞浆内, 其成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERKs, 主要为p44 MAPK和p42 MAPK)与细胞生长、分化和增殖的调控关系最为密切[3]。研究显示, MAPK激活(即Thr183和Tyr185残基磷酸化)在AngⅡ等多种致肥大因子介导的心肌肥大反应中起关键作用, 活化的MAPK主要被其磷酸酶去磷酸化而失活, 其中磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)最为重要[4,5]。本研究旨在利用培养的新生大鼠心肌细胞, 主要从MKP-1对MAPK去磷酸化调控的角度, 研究MAPK信号途径在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的作用及调控机制, 为深入研究心肌肥大的发生、发展和逆转机制提供新的思路和依据。

１材料和方法

1．1心肌细胞培养 按Simpson等描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以0.06%胰蛋白酶分离1～3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞, 采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养前的48 h, 在心肌细胞培养液中加入 0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿苷, 以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液, 72 h时开始用于药物实验。 1．2心肌细胞蛋白质含量和细胞表面积的测定 将心肌细胞分别接种于25 ml的培养瓶(测定细胞的蛋白质含量)或24 孔培养板(测定细胞直径、周径和表面积)中, 48 h后换无血清培养液, 72 h换入含有各种干预因素的无血清培养液。之后每2天换液1次, 到第8天收集细胞。用Bradford法[13]测定心肌细胞蛋白质含量, 并根据各瓶细胞数, 计算出每瓶细胞的总蛋白含量和每个心肌细胞的蛋白质含量。将贴壁生长的心肌细胞消化脱落后, 用IBAS图像处理系统测定心肌细胞直径、周径和表面积, 每孔测5个视野, 每个视野测10～15个细胞, 取其平均值。

1．3心肌细胞 3H-亮氨酸掺入测定 调细胞浓度至3×105/ml, 接种于24孔培养板上, 每孔1 ml。培养48 h后换为无血清培养基, 培养24 h后加入37 kBq 3H-亮氨酸及各种处理因子,继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定,洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中, 以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。

1．4MAPK活性测定[6] 用各种干预因素处理心肌细胞不同时间后, 弃去培养瓶中液体, 加入0.15ml蛋白提取液, 其组成为(mmol/L):β-磷酸甘油 20, benzanidine 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl 50, EDTA 5, EGTA 5, Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH7.4), Triton X-100 0.1%(v/v), PMSF 0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, β-巯基乙醇 0.3%(v/v)。收集细胞提取物, 4℃离心(13?000 r/min×10 min), 取上清液, 按Bradford法测量蛋白浓度, 调蛋白浓度至200 μg/ml, 免疫沉淀法提取MAPK蛋白。方法简述如下: 以琼脂糖结合的兔抗MAPK抗体(1∶20)于4℃共同振荡孵育2 h, 低温离心(4℃, 12?000 r/min 4次, 每次10 s)。其间以洗脱液充分洗脱沉淀, 最后用洗脱液悬浮, 得到MAPK蛋白的提取液。蛋白定量后加入等体积载样缓冲液, 加热变性蛋白(95℃, 5 min), 离心取上清进行SDS-PAGE。 凝胶内含有MBP(MAPK底物, 0.5 mg/ml), 电泳后凝胶经过异丙醇溶液洗脱、盐酸胍溶液变性、β-巯基乙醇和Tween-40溶液复性后在室温下分别与孵育缓冲液A及B(其组成参见文献[6], 孵育缓冲液B中含185 kBq的γ-32P-ATP)各孵育1 h, 以三氯乙酸洗脱凝胶, 进行放射自显影, 用IBAS图像处理系统扫描胶片测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。

1．5免疫印迹法测定MAPK蛋白表达[7] 用以上免疫提取液进行SDS-PAGE电泳, 电印迹转移法转至硝酸纤维素膜上, 以含1%BSA的TBST溶液室温封闭1 h, 分别与一抗(小鼠来源MAPK单克隆抗体, 1∶10?000稀释度)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG)室温各孵育1 h, 与ECL试剂反应1 min, X光胶片压片曝光1 min, _肐BAS图像处理系统对胶片扫描测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。

1．6免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达[7] 方法参见1.5, 以兔抗鼠MKP-1单克隆抗体为一抗, HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,其稀释度为1∶5?000, 蛋白杂交法测定MKP-1蛋白表达。

1．7试剂 小鼠来源MAPK磷酸化单克隆抗体、琼脂糖结合的兔抗MAPK抗体、兔抗大鼠MKP-1单克隆抗体、leupeptin、apoprotin、PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为: TTYADFIASGRRANAIHD)、AngⅡ、放线菌素D均购自Sigma公司, 化学发光增强剂(ECL)购自基因公司, 其中含辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG, [γ-32P]ATP、 3H-亮氨酸购自北京原子能研究所, CV11974由日本爱媛大学小野知原教授惠赠, MBP、PD098059、胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司, 其它试剂均为国产分析纯。

1．8统计学处理 数据以x±s表示, 进行秩和检验, P＜0.05表示差异有显著性意义。

2结果

2．1AngⅡ对蛋白质合成速率、蛋白质含量和细胞表面积的影响

在无血清培养液中, AngⅡ显著增加新生大鼠心肌细胞的 3H-亮氨酸掺入、蛋白质含量和心肌细胞表面积, 在10－8～10－6 mol/L范围内呈明显剂量依赖性。AngⅡ各浓度组细胞数目无显著性差异(P＞0.05, n=4)。 3H-亮氨酸掺入速率为蛋白合成的关键指标, 以10－７ mol/L作为AngⅡ的标准实验浓度, AngⅡ(10－７ mol/L)增加心肌细胞 3H-亮氨酸掺入的作用可被AT1受体阻断剂CV11974(为TCV-116活性代谢产物, 10－6 mol/L)明显抑制(蛋白掺入增加率由40%±8%降为6%±4%),而MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059 (5×10－5 mol/L)可部分抑制该反应(蛋白掺入增加率由40%±8%降为27%±8%)。以上结果表明, AngⅡ主要通过AT1受体介导心肌肥大反应, 抑制MAPK的激活, 可减轻但不能完全消除AngⅡ介导的心肌肥大反应。

2．2AngⅡ对MAPK活性的影响

凝胶内MAPK原位磷酸化结果显示, AngⅡ(10－７ mol/L)可明显增加新生大鼠心肌细胞p44MAPK和p42MAPK活性, 以p44MAPK和p42MAPK两个同型体的积分光密度之和表示MAPK活性。由于AngⅡ处理心肌细胞10 min作用最为明显, 故以AngⅡ处理10min为例。 AngⅡ(10－７ mol/L)可使凝胶感光密度较对照组增加169%±70% (P＜0.01, n=4)。而预先以CV11974 (10－４ mol/L)或PD098059(5×10－5 mol/L)处理心肌细胞, 相同浓度的AngⅡ(10－７ mol/L)仅使凝胶感光密度较对照组增加11%±6.2%及22%±15.5%, 明显低于单用AngⅡ处理组。 提示CV11974或PD098059可抑制AngⅡ对MAPK的激活, 结果见图3。

2．3AngⅡ对MAPK及MKP-1蛋白表达的影响

以针对 p44MAPK和p42MAPK两个同型体的MAPK单克隆抗体对 SDS-PAGE的凝胶结果进行免疫分析, 结果显示新生大鼠心肌细胞中MAPK这两个同型体皆有表达。用AngⅡ(10－７ mol/L)处理心肌细胞5 min,磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK及p42MAPK)表达即开始增加, 5、10、15、30 min及2 h时分别增加86%±39%、152%±32%、79%±31%、62%±32%、15%±13%, 说明AngⅡ增加心肌细胞磷酸化MAPK蛋白表在10 min左右时最明显, 可持续30 min以上, 2 h时磷酸化MAPK蛋白表达基本恢复正常以AngⅡ处理心肌细胞10 min,磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK及p42MAPK)表达为标准,Ⅱ.预先以CV11974(10－6 mol/L)或PD098059(5×10－5 mol/L)处理心肌细胞, 可明显抑制AngⅡ(10－７ mol/L)诱导的磷酸化MAPK蛋白表达。这与凝胶内MAPK原位磷酸化测定MAPK活性结果一致, 提示磷酸化MAPK表达增加主要由于蛋白磷酸化程度增加而非MAPK蛋白含量增加。

放线菌素D为MKP-1蛋白表达的抑制剂[9], 实验以放线菌素D (3 μg/ml)预先处理心肌细胞30 min, 再给予AngⅡ(10－７ mol/L)刺激, 可见各时间点MKP-1蛋白表达皆低于单用AngⅡ刺激组。但放线菌素D 处理组AngⅡ刺激2 h时心肌细胞磷酸化MAPK蛋白表达明显高于同时间单用AngⅡ刺激组(与刺激前相比, 分别增加76%±9%及15%±13%), 提示放线菌素D