摘要：用NADPH-d组织化学法, 观察鞘内注射NMDA受体拮抗剂MK-801对大鼠右后掌皮下注射甲醛诱发的炎症性痛及痛过敏过程中脊髓后角一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,同时测定一氧化氮(NO)代谢终产物NO－[]·3及NO－[]·2含量来观察这一过程中NO含量的变化。结果表明, 皮下注射甲醛24 h时, 双侧脊髓后角NOS的表达及腰膨大部位NO的含量明显增加;而注射甲醛前15 min及注射后12 h两次鞘内注射NMDA受体拮抗剂MK-801, 则明显抑制NOS的表达及NO含量的增加。以上结果表明:在大鼠后掌注射甲醛所引起的痛及痛过敏过程中, 脊髓后角NOS的表达和NO含量的增加是通过NMDA受体的活动来介导的。已有研究证实, 甲醛炎症性痛及痛过敏过程中脊髓后角神经元中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, nOS)表达增加[1,2]。我们的研究也进一步证实了这一现象[3]。但是, NOS增加的机制尚不完全清楚。研究表明,痛及痛过敏的形成与脊髓伤害性信息传递通路中兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, eAAs)的释放及这种释放所引起的EAA受体的活动增强与受体的表达上调有关[4~6]。 进一步研究发现, 这种由于 EAA 受体, 特别是 n-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受体的活动所引起的痛及痛过敏可被NOS抑制剂所阻断[7],鞘内注射L-arginine可产生快速、 短暂的剂量依赖性的热痛觉过敏状态, 此种热痛觉过敏出现的时程、 幅度都与NMDA所诱发的热痛觉过敏相似[8]。这些现象提示一氧化氮(nitric oxide, NO) 在NMDA受体激动所致的痛及痛过敏中发挥作用。但是, 尚无直接证据表明, 在这一过程中, nOS的表达及NO含量的增加是EAA受体活动的结果。因此,本实验的目的旨在观察NMDA受体拮抗剂MK-801对甲醛炎症性痛及痛过敏过程中脊髓后角NOS及NO含量变化的影响, 以探讨这一过程中NOS及NO增加的机制。

１材料和方法

1.1实验动物及分组健康纯种Sprague-Dawley大鼠50只(260~280g), 由河北医科大学实验动物中心提供, 雌雄不拘。动物分为四组:(1)对照组: 不加任何处理; (2) sham组: 鞘内插管, 并以鞘内注射2次生理盐水作为对照; (3)甲醛24 h组: 右后掌注射甲醛后24 h后取材;(4)甲醛+MK-801组: 鞘内插管, 于右后掌注射甲醛前15 min鞘内注射MK-801 1次, 12 h后再重复注射1次; 注射甲醛后24 h取材。

1.2试剂尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NADPH)、氯化硝基四氮唑蓝(nitro blue tetruzolium)、MK-801均为Sigma产品;一氧化氮测试盒为南京建成生物工程研究所产品。

1.3鞘内(intrathecal, it)插管及鞘内注射参照Yaksh和Rudy 所建立的方法[9]。1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉,于颈后部两耳连线中点做纵向切口, 向下切开皮肤、肌肉达枕骨与寰椎间的枕骨寰椎膜, 在此膜上切一小口, 从此处由头侧向尾侧插入一根PE-10管(外径1 mm),插入深度约8 cm, 达腰蛛网膜下池。术后每只动物单独饲养, 每天观察伤口情况, 剔除有伤口感染迹象及伤口裂开的动物。术后恢复5~7 d后,剔除有运动障碍的动物。鞘内注射采用微量进样器进行。

1.4炎性疼痛模型大鼠右后掌皮下注射5% 甲醛0.2 ml。

1.5灌注固定及取材常规多聚甲醛灌注、固定后打开椎板, 暴露脊髓, 找到第5腰神经节。从此神经节处沿后根向上找,找到的与此后根相连的脊髓节段即为与该神经节对应的腰髓。在L5后根的上、下端根丝处切断脊髓, 取出L5脊髓节段。所取标本置于4℃的多聚甲醛中固定4~6 h,随后移入15%蔗糖溶液中, 于4℃冰箱内存放至标本沉底, 再移入30%的蔗糖溶液至沉底。

1.6NADPH-黄递酶(NADPH-d)组化法将所取脊髓标本做横截面连续冰冻切片, 片厚40 μm, 以pH 7.4的0.1 mol/L的PB接片。NADPH-d反应以漂片法进行: 将切片移入含1.0 mg/ml的β-NADPH、0.5 mg/ml的NBT、1%Triton X-100和0.1 mol/L 的PB (pH 7.4)的混合液内, 置于37℃的温箱中温育4 h, 然后将切片移入0.1 mol/L PB (pH7.4)中终止反应。用PB漂洗3遍, 每次3 min, 再移入3% Triton X-100 中6 h。然后将标本捞至明胶玻片上铺展, 而后干燥、 脱水、透明、 封片。

1.7NADPH-d阳性结果的观察测定于光学显微镜下进行定性观察。采用ZL-2000型细胞分析系统进行定量分析,染色深度用吸光度(A值)表示。吸光度的计算公式为: 吸光度(A值)=log空白灰度值[]标本灰度值. 吸光度越大, 表明NADPH-d染色越深。

1.8腰髓中NO含量的测定大鼠断头后打开椎板, 剪取腰膨大部位脊髓, 称取0.2 g,立即放入－20℃冰箱中冷冻保存。应用南京建成生物工程研究所提供的NO试剂盒, 用硝酸还原酶法测定NO代谢产物(NO－[]·3+NO－[]·2)的含量,用于反映NO的含量。

1.9统计学处理数据用mean±SD表示。组间比较, 行样本均数间非配对t检验。以Ｐ＜0.05作为判断差异显著性的标准。

2结果

足底注射甲醛后1~2 min, 动物即出现疼痛相关反应, 如舔、 摇动后掌, 后掌抬离盒底面等, 30 min后注射部位开始出现炎症性反应,如红、肿等。这种反应于注射甲醛后24 h达到高峰, 约1周后消退。

2.1L5脊髓后角Ⅰ~Ⅲ板层NADPH-d阳性细胞数量的变化

对照组两侧的脊髓后角内, 可见到一些散在的NADPH-d阳性细胞, 分布密度较低, 数量较少。这些细胞多数呈菱形, 一些为圆形或卵圆形, 部分细胞可见明显的突起,提示这些细胞为神经细胞。sham组脊髓后角NADPH-d阳性细胞数及分布密度与对照组类似)。甲醛24 h组中可见脊髓后角中NADPH-d阳性细胞明显增加。这些细胞形态与对照组相同, 多数呈菱形, 一些为圆形或卵圆形,部分细胞可见明显的突起及纤细的神经纤维。与对照组和sham组相比较,本组NADPH-d阳性细胞的增加在统计学上有显著性意义(P＜0.01)。在甲醛+MK-801组中, 可见脊髓后角中NADPH-d阳性细胞的数目较甲醛24 h组显著减少(P＜0.01)。

2.2L5脊髓后角Ⅰ~Ⅲ板层NADPH-d阳性细胞染色深度的变化

如前所述, 用吸光度(A值)表示NADPH-d染色深度。与对照组相比, sham组大鼠L5脊髓后角Ⅰ~Ⅲ板层阳性细胞吸光度无变化(P＞0.05); 甲醛24 h组与对照组相比则双侧均明显增加(P＜0.01); 甲醛+MK-801组与甲醛24 h组相比双侧阳性细胞吸光度值明显降低(P＜0.01), 与对照组相比,则无显著性差异(P＞0.05)。

2.3L5脊髓后角Ⅰ~Ⅲ板层NADPH-d染色深度的变化

与对照组相比, sham组大鼠脊髓后角Ⅰ~Ⅲ板层吸光度无变化(P＞0.05), 甲醛24 h组双侧均增加(P＜0.01);甲醛+MK-801组脊髓后角Ⅰ~Ⅲ板层吸光度明显小于甲醛24 h组(P＜0.01), 与对照组相比则无显著性变化(P＞0.05)。

2.4L5脊髓后角Ⅳ~Ⅵ层NADPH-d染色深度的变化

注射甲醛后24 h时, 可见脊髓后角Ⅳ~Ⅵ层内NADPH-d染色深度明显增加。光镜下观察发现, 这些阳性组织除极少数神经细胞外, 其余主要为血管组织。测定比较吸光度发现, sham组吸光度与对照组相比无变化(P＞0.05), 甲醛24 h组与对照组相比则双侧均升高(P＜0.01); 甲醛+MK-801组两侧脊髓后角吸光度与甲醛24 h组相比均显著降低(P＜0.01),与对照组相比则无显著性差异(P＞0.05)。

2.5腰髓NO代谢产物含量的变化

与对照组相比, sham组NO含量无变化(P＞0.05), 甲醛24 h组显著升高(P＜0.01); 甲醛+MK-801组与甲醛24 h组相比, nO含量明显减少(P＜0.01), 与对照组相比则无显著性差异(P＞0.05)

3讨论

皮下注射甲醛为常用的化学性致痛和痛过敏方法。注射后, 动物出现早期的痛反应和随后的痛觉过敏, 表现为舔、摇动后掌, 后掌抬离盒底,对热刺激的耐受性下降等[10]。本实验中, 注射甲醛后, 动物的反应与文献描述一致, 表明动物出现了炎症性痛及痛过敏。伴随这些行为变化及注射部位局部的炎症反应,脊髓后角NADPH-d阳性细胞数量增加, 染色加深。已经证实NADPH-d染色是一种标记NOS的特异方法[11，12], 因此,注射甲醛后脊髓后角NADPH-d阳性细胞数量增加、 染色加深, 表明脊髓后角内NOS的表达增加。

脊髓后角NOS表达增多的组织细胞构成主要有以下三个方面: (1)NADPH-d阳性神经细胞数目增加和染色加深。这些阳性细胞多位于Ⅰ~Ⅲ板层,呈菱形、卵圆形或圆形, 部分细胞可见明显的突起。这些特点符合神经细胞的形态学特征。导致NADPH-d阳性神经细胞数目增多和染色加深的原因可能有以下两种:一是一些神经细胞本身即含有NOS, 但由于在正常情况下含量极低而染色较浅, 持续传递伤害性信息, 使细胞内NOS含量增加而使其染色加深;另一种可能是一些细胞在正常情况下并不含有NOS, 持续传递伤害性信息, 引起神经型NOS (neuronal NOS, nNOS) mRNA在蛋白水平的表达,而使含有NOS的神经元数量增加, 导致NADPH-d阳性染色神经元数量增多。(2) nADPH-d阳性神经纤维数量增加与染色加深。这一点可以从Ⅰ~Ⅲ板层中存在一些纤细的、或串珠样NADPH-d阳性染色神经纤维得到证实。NADPH-d阳性神经纤维的增加和染色加深表明在甲醛炎症性痛及痛过敏过程中,神经细胞轴突或树突内的NOS亦增加。(3)血管组织NOS的表达增多而使染出的NADPH-d阳性血管数量增加。

我们以往的实验结果证实, 大鼠右后掌注射甲醛后, 上述脊髓后角内NOS的表达增加在注射甲醛后24 h时最明显, 这一特点与24 h时注射部位的炎症反应密切相关。因此, 本实验中选择注射甲醛后24 h作为鞘内注射NMDA受体拮抗剂的对照,观察NMDA受体拮抗剂MK-801对右后掌皮下注射甲醛所致NOS表达增加的影响,