摘要：实验观察了一氧化氮(NO)前体L-精氨酸对肾性高血压大鼠心肌组织eNOS蛋白表达及亚硝酸盐/硝酸盐含量、MKP-1蛋白表达及MAPK活性的影响,以及与心肌肥厚的关系。采用两肾一夹Goldblatt肾性高血压模型, 随机分为5组: L-精氨酸高、中、低剂量组,分别于术后第5周给予L-精氨酸50、150及450 mg/kg; L-NAME组, 腹腔注射L-NAME 10 mg/kg, 同时给予L-精氨酸150 mg/kg; 高血压对照组, 正常饮水, 以及另设的一假手术对照组。用药8周后, 用插管法测量大鼠动脉血压、左心室重与体重比值, 用胶内原位磷酸化法测MAPK活性、免疫印迹法检测心肌组织eNOS及MKP-1蛋白表达、酶还原法测定心肌组织亚硝酸盐/硝酸盐含量。结果表明:(1) L-精氨酸可明显抑制肾动脉狭窄术后的血压升高、左心室重与体重比增加, 增加心肌组织eNOS、MKP-1蛋白表达及亚硝酸盐/硝酸盐含量, 降低心肌组织MAPK活性,其中以150 mg/kg组作用最为明显; (2) NOS抑制剂L-NAME可明显抑制L-精氨酸的以上作用。 肾性高血压大鼠心肌组织eNOS蛋白表达下降。NO生成减少及MKP-1蛋白表达下降以及MAPK活性增强可能与高血压及心肌肥厚形成有关, l-精氨酸通过促进心肌组织eNOS蛋白表达、增加NO产生和MKP-1表达、减弱MAPK活性而发挥抗高血压及心肌肥厚的作用。心肌肥大是高血压最常见的并发症, 既是高血压时心脏负荷过大引起心肌组织代偿性生长的结果, 也是心脏的病理性重构过程[1]。除致肥大因子外,机体内的抑制心肌肥大因子亦是人们寻找并研究的热点[2~4]。本研究室近来的研究揭示, 一氧化氮(nitric oxide, nO)对心肌肥大具有明显的抑制作用[5], 但NO抑制心肌肥大的机制尚不清楚。寻找信号传导通路的调控机制是揭示心肌肥大细胞分子机制的关键。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是目前发现的最主要的一个生长信号调节蛋白, 研究显示MAPK在多种致肥大因子介导的心肌肥大反应中起关键作用, 活化的MAPK(即MAPK中的酪氨酸和苏氨酸残基磷酸化)主要因被其磷酸酶去磷酸化而失活, 其中MAPK磷酸酶-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)作用最为重要[6,7]。本文通过研究L-精氨酸对两肾一夹肾性高血压大鼠心肌肥大形成过程中心肌组织eNOS的蛋白表达及NO产量、MKP-1蛋白表达及MAPK活性的影响,探讨MAPK及其磷酸酶MKP-1在一氧化氮抑制心肌肥大发生发展中的作用, 为深入研究心肌肥大的发生发展机制提供新的思路和依据。

１材料和方法

1.1材料和试剂髓磷脂碱性蛋白(myeolin basic protein, MBP)购自Gibco公司; L-精氨酸、N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)、leupeptin、apoprotinin、PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为: tTYADFIASGRRANAIHD)均为Sigma公司产品; 化学发光增强剂(ECL)试剂盒(Phototope-HRP Western Blot detection Kit)为New England Biolab公司产品, 亚硝酸盐/硝酸盐比色法试剂盒为Boehringer mannheim公司产品。其它试剂均为国产分析纯。仪器有: RM-6000多道生理记录仪(日本光电公司), Eppendorf 5417R型低温离心机(德国Eppendorf公司), mini-ProteanⅡ电泳槽、电转印槽、基因扩增仪(美国Bio-Rad公司), IBAS图像分析系统(德国Kontron Elektronik公司), uVP-GDS8000凝胶成像系统和CECIL2020紫外分光光度计(英国)。

1.2两肾一夹肾性高血压大鼠模型制作及处理(1) 雄性Sprague-Dawley 大鼠(150~200 g)购自中山医科大学实验动物中心。按Kuwajima法制备两肾一夹Goldblatt肾性高血压模型[8,9]: 用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后, 动物取右侧卧位暴露左肾区, 在左肋弓下、旁开脊柱0.5 cm处作一切口, 入腹腔探出左肾, 分离出肾动脉; 上一内径为0.25 mm的银夹, 使肾动脉狭窄, 制成两肾一夹Goldblatt肾性高血压模型。(2)大鼠称重并记录, 用戊巴比妥钠腹腔麻醉后进行左侧颈总动脉插管, 以RM-6000多道生理记录仪测量平均动脉压。然后开胸取心脏, 剪开心腔,以预冷的生理盐水洗去血液, 滤纸吸干水分, 用电子天平准确称量左心室(包括室间隔)重量, 计算左心室重与体重比值(LVW/BW)。左心室称量后迅速分装约0.2 g/份, 置于－70℃低温冰箱冻存备用。

1.3实验分组肾动脉狭窄术后4周, 将肾性高血压大鼠分成5组, 每组10只, 分别给予以下处理。(1) 高血压对照组: 正常饮水。(2) L-精氨酸低剂量组:饮水中含L-精氨酸, 摄入量为50 mg/kg。(3) L-精氨酸中剂量组: 饮水中含L-精氨酸, 摄入量为150 mg/kg。(4) L-精氨酸高剂量组:饮水中含L-精氨酸, 摄入量为450 mg/kg。(5) L-NAME组: 腹腔注射NOS抑制剂L-NAME 10 mg/kg, 且饮水中含L-精氨酸,摄入量为150 mg/kg。以上5组皆持续给药8周。(6) 假手术对照组: 正常饮水。各组于术后12周进行下一步实验。

1.4MAPK活性测定[10]取约0.2 g组织在冰浴下研碎后加入1.0 ml蛋白提取液, 其组成为(mmol/L): β-磷酸甘油 20, benzamidine 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl 50, EDTA 5, EGTA 5, Na3VO4 0.2, HEPES 10(pH7.4), 0.1% Triton X-100, PMSF 0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, 0.03%β-巯基乙醇。组织匀浆后4℃离心 , 13?000 r/min, 10 min, 取上清液, 按Bradford法测量蛋白浓度[12]。调蛋白质量浓度至200 mg/L, 以琼脂糖结合的兔抗MAPK抗体(1∶20)4℃共同振荡孵育2 h, 以蛋白提取液充分洗脱沉淀(12?000 r/min 离心4次, 每次10 s), 取50 μL加入等体积载样缓冲液, 进行SDS-PAGE。凝胶内含有0.5 g/L MBP, 电泳后凝胶与孵育缓冲液A(50 mmol/L HEPES, pH=7.4, 5 mmol/L β-巯基乙醇)孵育: 与含20%异丙醇的缓冲液A孵育30 min 2次; 缓冲液A孵育1 h; 与含6 mol/L盐酸胍的缓冲液A孵育30 min 2次; 与含0.04% Tween-20的缓冲液A在4℃孵育16和2 h; 与含100 μmol/L na3VO4、10 mmol/L MgCl2的缓冲液A在30℃孵育30 min; 与含100 μmol/L Na3VO4、10 mmol/L MgCl2、50μmol/L ATP、0.185 MBq的[γ-32P]-ATP的缓冲液A在30℃孵育1 h。这样经过异丙醇溶液洗脱、盐酸胍溶液变性、β-巯基乙醇和Tween溶液复性,掺入γ-32P后, 以10 μmol/L焦磷酸钠和5%三氯乙酸固定液洗脱凝胶, 终止反应。进行放射自显影, X光胶片压片感光, 以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描,测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。

1.5免疫印迹法检测eNOS及MKP-1蛋白表达[11]将以上免疫提取液蛋白质定量后, 调浓度至200 μg/μl, 然后进行SDS-PAGE电泳,上样量为25 μl。电印迹转移法将凝胶内的蛋白质转至硝酸纤维素膜上, 用含1%小牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1.5 h。 再分别与一抗:兔抗大鼠eNOS单克隆抗体或兔抗大鼠MKP-1单克隆抗体(稀释度皆为1∶4?000) 4℃孵育过夜, TBST溶液洗脱3次。 再与二抗: 羊抗兔IgG抗体(稀释度为1∶2?000)室温孵育1 h, TBST溶液洗脱3次后与ECL试剂反应1 min。 X光胶片压片曝光10~60 s, 以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度,并进行积分处理。

1.6亚硝酸盐/硝酸盐含量的测定[12]由于生物系统中NO释放后很快转变为亚硝酸盐(NO-２)和硝酸盐(NO-３), 两者性质稳定,因而可以通过测定亚硝酸盐/硝酸盐含量来间接反映NO的生成量。

1.6.1样品制备取心肌组织迅速剪碎, 加入冰预冷的0.3 N高氯酸进行匀浆(冰浴)。收集组织匀浆液于1.5 ml离心管中, 12?000 r/min,4℃离心10 min, 然后取上清于另一离心管中待测。

1.6.2亚硝酸盐/硝酸盐含量的测定按照亚硝酸盐/硝酸盐比色法试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)说明, 以亚硝酸钠、硝酸钾为标准品,制作亚硝酸盐/硝酸盐标准曲线, 求出相应的直线回归方程; 然后测定样品的光密度值, 根据标准曲线方程求出相应的亚硝酸盐/硝酸盐含量;最后根据各样品的组织蛋白定量, 求出每毫克蛋白中亚硝酸盐/硝酸盐含量。

1. 7统计学处理数据以mean±SD表示。组间及组内比较采用方差分析。

2结果

2.1L-精氨酸对肾性高血压大鼠的血压及左心室重/体重比值的影响

肾动脉狭窄术后12周大鼠血压及左心室重与体重比值皆明显高于同期假手术对照组, 而L-精氨酸50、150、450 mg/kg皆可明显降低肾性高血压大鼠平均动脉血压和左心室重/体重比, 说明L-精氨酸具有降压及抑制心肌肥厚的作用, 但以150 mg/kg作用最为明显。若同时应用NOS抑制剂L-NAME 10 mg/kg, 则可明显抑制L-精氨酸 150 mg/kg组的降压及抑制心肌肥大的作用(表1)。

2.2L-精氨酸对RHR心肌组织eNOS蛋白表达及亚硝酸盐/硝酸盐含量的影响

肾动脉狭窄术后12周大鼠心肌组织eNOS和蛋白表达、 亚硝酸盐/硝酸盐(NOx)含量明显低于同期假手术对照组, L-精氨酸50 mg/kg、 150 mg/kg、450 mg/kg组eNOS蛋白表达较RHR组分别增加37%、95%和37%; NOx含量较RHR组分别增加23%、47%和26%。L-NAME可明显抑制L-精氨酸的上述作用。以上结果提示, l-精氨酸抑制心肌肥厚作用可能与诱导eNOS表达及增加NO生成有关。

2.3L-精氨酸对RHR心肌组织MKP-1蛋白表达以及MAPK活性的影响

l-精氨酸50、150、450 mg/kg组MKP-1蛋白表达较肾性高血压大鼠对照组分别增加7%、19%、7%; 但MAPK蛋白活性比肾性高血压大鼠对照组分别降低24%、30%、21%;提示L-精氨酸持续给药可诱导MKP-1蛋白表达、降低MAPK活性, 该效应也以150 mg/kg作用最为明显, 并可被NOS抑制剂L-NAME所明显抑制。

3讨论

以往对高血压心肌肥大的研究主要集中在致肥大因子方面。已经明确, 压力超负荷及某些生长因子如α1受体激动剂、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ等是导致心肌肥大的重要因子,对其导致心肌<