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在成年神经系统中, 大多数神经元是完全分化的, 一旦损伤便不能再生。而嗅觉上皮(olfactory epithelium, OE)很特殊,它能够在一生中不断产生新的神经元［5,20］。OE是一种假复层柱状上皮, 包含嗅神经元、支持细胞和基底细胞。基底细胞能产生嗅神经元和嗅鞘细胞。嗅神经元伸出一根短树突到上皮游离面形成嗅泡, 嗅泡内含有嗅觉受体, 并伸出一根长轴突到嗅球［6］ 。
OE细胞增殖速度可以通过手术创伤或化学损伤而改变。研究证明疾病或创伤能影响OE细胞中一些蛋白的表达。例如, Alzheimer病患者OE中的淀粉样蛋白前体的加工过程发生改变［22］;人类神经疾病能增加OE细胞中神经细丝亚单位的表达［18］。
以前实验显示, 硫酸锌(ZnSO4)创伤能刺激离体和在体的成年小鼠OE基底细胞的分裂活性。培养的OE 包括双极细胞、 窝细胞、梭形细胞及大细胞［17］。一些研究报道, 胚胎或新生大鼠、 小鼠、 鸡和人的分散的OE细胞［1,4,10,15,16,19］,能成功地离体培养1周［2］到1年［19］, 其中的一部分细胞能表达许多神经元抗原, 包括神经细胞粘着分子(neural cell adhesion molecule, N-CAM), 神经元特有微管蛋白(neuron-specific tubulin, NST),微管相关蛋白-5(microtubule-associated protein-5, MAP5), 神经丝蛋白(neurofilament protein, nF), 生长相关蛋白-43(growth-associated protein 43, GAP-43)和神经元特异烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)［1,4,14,16,19,20］。只有5%的嗅神经元表达嗅觉标记蛋白(olfactory marker protein, OMP),这种蛋白仅存于成熟的嗅神经元中［19］。而另一些嗅神经元在离体培养时却表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, gFAP, 星形胶质细胞标记物)［23］, 表明这些细胞并没有完全分化。
单独应用或组合应用神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)能加强离体和在体生长的OE细胞增殖和分化。例如,神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、 白介素-1β(interleukin-1β)和白介素-6的组合能刺激离体人的嗅神经元突起生长［20］。有报道,脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)能增强在体和离体神经元的生存;成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)能刺激离体胚胎OE中嗅神经元前体细胞的分化［7］。
本研究目的在于观察bFGF和BDNF对离体培养OE中各种细胞的数量和双极细胞突起长度的影响。
1材料和方法
1.1ZnSO4 处理和细胞培养每次实验, 至少有6只2～3月龄、 体重20～24g的小鼠(Charles River, Wilmington, MA, uSA)用ZnSO4处理, 重复3次。处理及细胞培养方法如前所述［17］, 作以下改进: (1) 鼻滴时间延长到30 min, 以确保OE充分浸润;(2)当胰酶被OE培养基(OE medium, OEM)失活后, 将分散的细胞液离心, 弃上清液; 加入OEM, 再次离心; (3)将OE细胞分别接种到5%血清OEM和10%血清的OEM上;(4)离体培养1 d后, 1.5 ml OEM加到每个盒内的盖玻片上, 无需去除旧培养基。每5天换1次培养基。
所有培养基成分都购自GIBCO公司(Grand Island, NY, USA)。 在开始的研究中, 对培养的活OE作慢转速摄影后用普通转速放映的录像分析。
1.2免疫组化研究方法同前所述［17］, 作以下改进: 阻断用2%的牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) (Sigma, uSA), 一抗和二抗都稀释在2% BSA中。一抗包括: (1)单克隆抗体: 抗肌动蛋白 (anti-actin,1∶200, Boehringer monnheim, USA),抗GFAP (1∶4, Soehringer), 抗低亲和力神经生长因子受体 (p75NGFr)(1∶10, Sigma),抗有丝分裂活化蛋白激酶-2 (MAP2) (1∶250, Boehrunger), 抗微管蛋白(tubulin, 1∶50, Amersham, USA);(2)多克隆抗体: 抗GFAP (1∶20, Dako, USA), 抗角蛋白 keratin (1∶20, Sigma), 抗NF 200 kD(NF200, 1∶100, Sigma), 抗NSE (1∶50, Incstar, Still Water, USA), 抗OMP (Frank margolis博士自制、 赠送), 抗-tau (1∶100, Chemicon), 抗-tubulin (1∶20, ICN, Costa Mesa, uSA)
1.3bFGF和BDNF对培养OE的影响OE离体培养第3天, 将BDNF、 bFGF或bFGF与BDNF的组合分别加到5%血清的OEM及10%血清的OEM中,并一直保持直到固定用于免疫荧光。所有药剂的浓度(ng/ml): BDNF(Intergen, USA) 100, bFGF (Boehringer) 50。 bFGF与BDNF的组合: bFGF 50 ng/ml, BDNF100ng/ml。
培养的OE分成8组: (5%)对照组(在5%血清OEM中), (5%)bFGF组(在5%血清OEM中加入bFGF), (5%) BDNF组(在5%血清OEM中加入BDNF), (5%) bFGF与BDNF组合组(在5%血清OEM中加入bFGF和 BDNF);(10%)对照组(在10%血清OEM中), (10%)bFGF组 (在10%血清OEM中加入bFGF), (10%) BDNF组 (在10%血清OEM中加入BDNF),(10%) bFGF 与 BDNF组合组 (在10%血清OEM中加入bFGF和 BDNF)。
培养6、 9、 14 d后,在每片5个随机视野中计算每种细胞的细胞数并测量双极细胞的长、 短突起长度(用目测微尺和台测微尺), 每组3片, 结果用±s表示, 并作t-test分析。
用bFGF 与BDNF组合处理过的培养OE细胞, 先用细胞荧光追踪剂DiI(Molecular Probes, Eugene, Oregon, uSA)处理(DiI浓度: 8 μg/ml), 然后移植入大鼠脊髓中, 7 d后对移植处脊髓做冰冻切片并在荧光显微镜下观察。
2结果
2.1离体培养的OE
培养的OE由不同形态的细胞所组成。在培养第1～3天, 可观察到大量的细胞碎片、 圆形细胞、扁多角形细胞及一些成群的上皮细胞。这些成群上皮细胞被称作“窝形”细胞。一些纺锤形细胞先伸出一根突起, 然后再伸出第二根突起, 形成双极细胞。培养5 d后,双极细胞、 窝形细胞、 大细胞和梭形成细胞可区分开来(图1A～C, 见196页)。对培养的活OE作慢转速摄影后用普通转速放映的录像分析显示,一些梭形细胞长出突起形成双极细胞, 而大细胞将核、 质移到一边, 最后形成梭形的双极细胞。
2.2离体培养OE的免疫组化特征
窝形细胞呈keratin免疫染色阳性, 细胞中围绕核的细丝染色极强, 这表明窝形细胞具有上皮特征。同时, 窝形细胞也呈actin、 tubulin染色阳性;但对NF200、 GFAP、 OMP及其它神经元特有抗体都呈免疫反应阴性。窝形细胞在培养的OE中一直生长, 成群的细胞数越来越多,在培养的盖玻片上占很大的区域。这显示窝形细胞的分裂能力极强 (图1D)。
图1.ZnSO4处理4 d后的离体培养成年小鼠的OE
fig.1.Mouse adult olfactory epithelia cultured in vitro 4 days after an in situ ZnSO4 treatment. 110×, phase contrast optics. A． Four major cell types: bipolar, nest, fusiform and giant cells in 10% serum OE medium (OEM) with the addition of the combination of bFGF and BDNF, in 6 DIV. B． Showing many more cells in 10% serum OEM with the addition of the combination of bFGF and BDNF, in9 DIV. C. The bipolar cells that usually exhibit asymmetric process development with a short and a long process in 10% serum OEM with the addition of the combination of bFGF and BDNF, in 14 DIV. D．The nest cell keeping the mitotic activity in 10% serum OEM with the addition of combined bFGF and BDNF, in 14 dIV.
一些大细胞呈actin、 tubulin免疫染色阳性反应; 另外少量大细胞对GFAP染色为阳性而对神经元特有抗体染色为阴性。
一些双极细胞的核周部及突起可见NF200 免疫染色阳性, 在高分辨共聚焦显微镜下胞质中可见OMP染色阳性的环形结构。同时, 50%以上双极细胞NSE、 mAP2、 tau蛋白免疫染色阳性, 其染色分布同NF200; 而GFAP、 keratin、 p75NGFr染色阴性。
2．3bFGF和BDNF对离体培养OE细胞数的影响
培养6～14 d后, 在(10%)bFGF组、 (10%)BDNF组、 (10%)bFGF与BDNF组合组中,双极细胞数均比(10%)对照组明显增加(P＜0.05)。双极细胞在(10%)bFGF与BDNF组合组中, 从7.1/mm2(对照组)增加到 22.3/mm2(P＜0.05), 它在细胞总数中的比例从对照组的28.1%上升到52.6% (P＜0.05)(图3); 其中, (10%)bFGF与BDNF组合组中双极细胞又比(10%)bFGF组或(10%)BDNF组明显增加(P＜0.05) (图2), 而大细胞的比例却从对照组的24.1%减到11.1% (P＜0.05)、 梭形细胞从22.1%减到13.7% (P＜0.05)(图3)。
