摘要：利用小牛胸主动脉内皮细胞(BAECs)作为模型, 观察17β-雌二醇(E₂)对BAECs一氧化氮(NO)释放、一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达和细胞内钙(［Ca²⁺］_i)的影响,以及雌激素受体(ER)拮抗剂tamoxifen和NOS抑制剂(L-NAME)的作用。结果显示, E₂ (10^－12～10^－8 mol/L)呈浓度依赖性促进BAECs中NO的释放, 以10^－8 mol/L浓度E₂处理BAECs 48 h,可见eNOS mRNA表达明显增加, 这些作用均可被tamoxifen (10^－7 mol/L)和L-NAME (10^－6 mol/L)明显抑制; E₂ (10^－8 mol/L)处理48 h可使BAECs静息［Ca²⁺］_i和ATP诱导的［Ca²⁺］_i上升幅度均显著增加。提示E₂能促进BAECs的NO释放和eNOS mRNA表达, 该作用至少部分通过ER介导, 并可能与细胞内钙动员有关。雌激素具有重要的心血管保护作用^［1］,主要表现在降低血脂、 保护内皮、 抑制血管平滑肌细胞增殖迁移、血小板粘附聚集、 减少动脉粥样硬化斑块形成和促进斑块消退等方面。近几年的研究提示,雌激素的抗动脉粥样硬化作用可能与一氧化氮(nitric oxide, NO)有关^［2］。NO存在于多种组织细胞中,包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs), 它不仅是调节血管张力的重要因子, 而且在抑制VSMCs增殖迁移等方面发挥了重要的生理作用。但目前由于雌激素心血管保护效应与NO的关系及其受体机制,以及细胞内信号传导途径还不十分清楚, 而且对其与细胞内钙的关系亦存在争议^［3,4］。 本研究旨在培养的小牛胸主动脉内皮细胞(BAECs)上,观察17β-雌二醇(E₂)对NO释放、 eNOS mRNA表达和细胞内钙(［Ca²⁺］_i)的影响及雌激素受体(ER)在其中的作用,以进一步探讨雌激素对BAEC的作用与NO的关系。

1材料和方法

1.1BAECs的培养在无菌条件下取新生小牛(广州市奶牛研究所提供)的胸主动脉, 按Ishikawa等^［5］的方法分离、培养BAECs,原代BAECs呈铺路石状, Ⅷ因子染色阳性。实验采用传代培养第3～5代的细胞, 培养液为含10%小牛血清的无酚红DMEM, 给药前24 h换用无血清而加入转铁蛋白等补充营养的无酚红DMEM。

1.2NO释放的测定^［6］采用Nitrit/Nitrat Farbtest试剂盒,用比色法测定培养液和细胞内的硝酸盐总量。以每培养瓶10⁶个细胞的密度接种细胞, 分别收集细胞培养液和细胞裂解液(80℃恒温水浴裂解10 min, 12?000 r/min, 离心10 min, 取上清液)进行测定。500 μl样品中加入250 μl NADPH和200 μl硝酸还原酶,室温下孵育30 min, 加入对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺显色15 min, 以紫外分光光度计546 μm波长测定吸光度,再根据标准曲线换算成硝酸盐浓度。细胞培养液和细胞裂解液中硝酸盐浓度之和即为BAECs释放出的硝酸盐总量。

1.3eNOS mRNA的表达检测用TRIzol试剂盒提取细胞RNA, 提取后用紫外分光光度计测定其浓度和纯度, 计算样品总RNA浓度。根据Nadaud等^［7］报道的序列合成BAECs的eNOS寡核苷酸引物,其序列为: 上游5′-AAC ATG TGT CCT TGC TCG AGG CA-3′,下游5′-TTC CGG CGTCCA CCT GAT CCT aA-3′。利用该对引物可扩增出443 bp的eNOS cDNA片段。内标GAPDH的寡核苷酸引物是根据Fort等^［8］报道的序列合成:上游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′, 下游 5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′。取样品总RNA2 μg, 加入0.4 μmol/L 特异性eNOS mRNA引物, 采用Titan^TM一步法RT-PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应(RT-RCR),总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物8 μl, 加2 μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳条件为68 V,45 min。以GDS凝胶成像系统拍摄电泳图谱, 并进行分析。

1.4BAECs内游离钙浓度测定^［3］采用荧光法测定BAECs内游离钙离子浓度(［Ca²⁺］_i)。BAECs悬液内加入终浓度为2μmol/L的Fura-2/AM,37℃下孵育50 min, 用2 g/L牛血清白蛋白K-H液洗3次。将负载Fura-2/AM的细胞悬液2.5 ml,置于RF-5000双波长荧光分光光度计上进行测定。固定发射波波长(Em)505 nm, 固定激发波长(Ex)在380和340 nm采样间隔为1 s,测定340与380 nm的荧光强度比值。在λex=340 nm,λem=505 nm条件下, 测得BAECs悬液的基础荧光值F, 加入0.1% Triton x-100破膜, 使细胞内过剩的Fura-2与细胞外Ca²⁺结合, 测出最大荧光值F_max; 再加入5 mmol/L eGTA络合Ca²⁺, 使Fura-2游离, 测定最小荧光值F_min。记录给药前后的荧光比值,按公式计算胞浆内钙离子浓度: ［Ca²⁺］_i=Kd［(F－F_min/(F_max－F)］(nmol/L)。输入测得的数据F_max、F_min、F及Kd=224 nm, 由RF-5000钙测定系统软件求出BAECs的［Ca²⁺］_i。

1.5试剂Nitrit/Nitrat, Farbtest试剂和Titan^TM one Tube RT-PCR Kit均由Boehringer mannheim公司提供, TRIzol试剂、 DMEM为Gibco产品, 17β-雌二醇(17β-estraoliol,E₂)、 tamoxifen、 琼脂糖(Agrose), Fura-2/AM均为Sigma产品, eNOS引物序列和GAPDH引物序列由上海生工生物工程公司合成。

1.6实验分组(1)对照组; (2)E₂组; (3)Tamoxifen+E₂组; (4)L-NAME+E₂组;(5)Tamoxifen组; (6)L-NAME组。

1.7统计处理结果用x±s表示, 作方差分析、 组间t检验处理, P＜0.05被认为有统计学差异。

2结果

2.1E₂对NO释放的影响NO释放量用培养液和细胞内硝酸盐总量之和表示。与对照组比较,分别以10^－12 、10^－10及10^－8 mol/L的E₂处理BAECs48 h, 可使培养液和细胞内硝酸盐总量分别增加(12.2±5)%, (62.1±13)%和(97.38±8)% (n=4, p＜0.05)。分别以雌激素受体拮抗剂tamoxifen(10^－7 mol/L)或NOS抑制剂L-NAME (10^－6 mol/L)预处理BAECs 1 h后, 再加E₂ (10^－8 mol/L)处理48 h, BAECs产生的硝酸盐总量与单纯E₂(10^－8 mol/L)处理组相比分别减少(44.2±4)%及(48.7±4)%(n=4,P＜0.001),而单纯的tamo～xi～fen或 L-NAME 处理组的 bAECs 48 h产生的硝酸盐总量与对照组相比无明显差异(P＞0.05, 图1)。

图1.不同浓度17β-雌二醇对BAECs硝酸盐产量及L-NAME和tamoxifen对17β-雌二醇作用的影响

fig. 1.Effect of 17β-estradiol (10^－12,10^－10, 10^－8 mol/L) on the nitrate production in BAECs and effect of L-NAME and tamoxifen on the effect of 17β-estradiol.

2.2E₂对eNOS mRMA表达的影响

与对照组比较, 用E₂ (10^－8 mol/L)处理BAECs 1 h后即可见其eNOS mRNA表达丰度有所增加, 16 h后明显增加, 以48 h后表达丰度最强。用tamoxifen (10^－7 mol/L)或L-NAME(10^－6 mol/L)预处理BAECs 1 h后再以E₂ (10^－8 mol/L)处理48 h, eNOS mRNA表达低于单纯E₂ (10^－8 mol/L)处理组(图2、3)。

图2.17β-雌二醇对BAECs eNOS mRMA表达的影响

fig. 2.Effect of 17β-estradiol (10^－8 mol/L) on the expression of eNOS mRNA in cultured BAECs. RT-PCR for eNOS was per～formed in con～trol and17β-estradiol(E₂)-treated cells. ENOS cDNA was evident at 443 bp. lane 1, control; lane 2, E₂ 10^－8 mol/L, 1 h; lane 3, E₂10^－8 mol/L, 16 h; lane 4, E₂ 10^－8 mol/L, 48 h; lane 5, GAPDH; lane 6, marker.

图3.L-NAME及tamoxifen对17β-雌二醇诱导的BAECs eNOS mRMA表达的影响

fig. 3.Effects of L-NAME (10^－6 mol/L) and tamoxifen (10^－7 mol/L) on the expression of eNOS mRNA induced by E₂ (10^－8 mol/L) in BAECs. Lane 1, control; lane 2, E₂ 10^－8 mol/L,48 h; lane 3, tamoxifen 10^－7 mol/L+E₂ 10^－8 mol/L; lane 4, L-NAME 10^－6 mol/L+E₂ 10^－8 mol/L; lane 5, GAPDH; lane 6, marker.

2.3E₂对［Ca²⁺］_i的影响

以10^－8 mol/L的 E₂处理BAECs, 不能迅速引起［Ca²⁺］_i水平变化,增大浓度也无明显影响。E₂ (10