摘要：实验在培养的大鼠海马神经元中观察了重组人白细胞介素-6(recombinant human interleukin-6, rhIL-6)对缺氧-复氧后Bcl-2、Bax表达和神经元凋亡的影响。把培养12 d的大鼠海马神经元分为对照组和rhIL-6组，同时于缺氧环境(90% n2+10% CO2)中培养2、4 h后, 再于常氧培养箱内复氧培养24和72 h。于不同时间取出，分别用抗Bcl-2和Bax 抗血清进行免疫组织化学染色,观察缺氧-复氧后大鼠海马培养神经元Bcl-2和Bax的表达，并用原位末端标记(TUNEL)法和流式细胞术分别检测缺氧-复氧对体外培养海马神经元凋亡的影响。结果可见，与缺氧前相比，缺氧-复氧后24和72 h，海马神经元Bcl-2表达明显减弱，Bax表达明显增强, 凋亡神经元明显增多。经rhIL-6预处理的海马神经元与对照组相比，缺氧-复氧后24和72 h，Bcl-2表达明显增强，Bax表达明显减弱, 凋亡神经元明显减少。本实验结果提示, rhIL-6对海马神经元缺氧-复氧损伤具有一定的保护作用。Bcl-2原癌基因蛋白是位于线粒体膜或核膜及溶酶体膜的膜蛋白, 其作用可抑制细胞调凋亡。Bax基因虽属Bcl-2基因家属, 但功能与Bcl-2基因相反,它可与Bcl-2 蛋白形成异二聚体, 从而使Bcl-2蛋白失活, 因此对细胞凋亡有促进作用。近年来的研究表明, Bcl-2 和Bax基因不但在淋巴系统表达,也在神经系统表达[1], 它们相互作用, 共同调控细胞凋亡[2]。但有关缺氧-复氧对体外培养海马神经元Bcl-2和Bax表达的影响及其与神经元凋亡关系的研究报道甚少。鉴于我们以前的工作,证实rhIL-6能增强海马神经元的抗缺氧能力[3], 但rhIL-6能否影响缺氧-复氧后神经元Bcl-2、Bax的表达和神经元凋亡尚不清楚。 为此,本实验用免疫组织化学方法观察rhIL-6对缺氧-复氧后体外培养大鼠海马培养神经元Bcl-2和Bax的表达, 并用核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)方法和流式细胞仪分别检测rhIL-6对缺氧-复氧后培养海马神经元凋亡的影响,并对其相互关系作了探讨。

1材料和方法

1.1 海马神经元培养按已有的细胞培养方法进行海马神经元培养[3]。 取初生的 Wistar 大鼠，在无菌条件下分离出双侧海马, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化(37℃、30 min)分散后制成5×108 cells/L的细胞悬液, 接种于涂有小牛皮胶的35 mm塑料培养皿中, 每皿2 ml，置于36℃、含90%空气、10% CO2的培养箱(美国FORMA)内进行培养。培养液由 9.4 g/L Eagle′s MEM, 0.05 L/L马血清,0.01 L/L N3组合液[3]和谷氨酰胺0.10 g/L组成。于培养第3天，在培养液中分别加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷3 mg/L,以抑制非神经细胞的过度增殖, 48 h后更换新鲜培养液, 以后每周换液2次, 每次更换一半新鲜培养液。

1.2 缺氧-复氧实验取培养12 d的海马神经元, 按实验分为对照和rhIL-6两组。 rhIL-6组缺氧前24 h在培养液中加入 0.5 MU/L rhIL-6(本所王嘉玺教授提供的基因工程产品，SDS-PAGE＞98%,＞0.1 GU/mg), 对照组给于等量PBS, 然后将两组细胞同时移至2000 cm3的恒温(36℃)密闭容器内, 连续充以无氧气体(90% N2、10% CO2)，流速为0.20 L/min, 在缺氧条件下继续培养 2和4 h 后取出,置于含90%空气、10% CO2的培养箱内复氧培养24和72 h。

1.3 培养神经元的Bcl-2和Bax免疫组织化学观察取两组海马神经元, 于不同缺氧-复氧时间取出, 经40 g/L多聚甲醛固定后，分别用抗Bcl-2和抗Bax抗血清(美国 santa Cruz 公司产品)按1∶500稀释, 并按ABC法进行免疫组织化学染色,用Ni-DAB-葡萄糖氧化酶系统显色。同时设替代对照(用正常羊血清替代第一抗体), 并作显微照相和在QUANTIMET 970图像分析仪(Cambridge instruments company)上用光密度组件对Bcl-2和Bax表达神经元作平均光密度(OD)测定。每皿细胞观察25个视野, 每个实验观察2皿细胞,实验重复3次。

1.4 培养神经元的DNA原位末端标记采用德国宝灵曼公司的细胞凋亡捡测试剂盒(Cat NO 168487), 依据 wijsma[4]等报道的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP-Biotin 缺口末端标记(TUNEL)法作了改进, 其步骤如下:取缺氧-复氧培养各组海马神经元, 经40 g/L多聚甲醛固定1.5 h后, 用1% Triton X-100/PBS处理1.5 h, 再加1 ml蛋白酶K(1 mg/L PBS)室温消化15 min, 随后用0.3% H2O2作用30 min, 中和内源性过氧化酶, 然后用TdT缓冲液50 μl室温孵育1 h,用PBS洗3次后, 加入TdT/生物素-dUDP混合液50 μl, 并复以石蜡薄膜, 置于37℃湿盒内孵育2 h, 用PBS洗3次后,再加入亲合素-过氧化物酶工作液(Avidin-POD)50 μl, 置于37℃湿盒内孵育2 h, 最后用 ni-DAB-葡萄糖氧化酶显色系统显色。同时设替代对照(用TdT缓冲液替代TdT/生物素-dUTP 混合液),并作显微照相和在倒置相差显微镜(200×)下每皿按Z字顺序计数25个相邻视野(0.16 mm2/视野)中TUNEL染色阳性和阴性神经元数目,计算凋亡神经元所占百分率。每个实验组观察2皿细胞, 实验重复3次。

1.5 用流式细胞仪测定神经细胞凋亡取缺氧-复氧培养各组海马神经元, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化(37℃、30 min)分散, 置于4℃冷乙醇中固定后,在1×109个细胞/L密度的细胞悬液中加入1 ml碘化丙啶(PI)染液(100 mg/L), 4℃染色30 min, 用FAC-Scan (Becton dickinson， CA， USA)流式细胞仪测定荧光强度， 激发波长488 nm，每次测定106 个细胞。采用Modfit 分析软件进行细胞DNA含量分析，低于G1 期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。

1.6 统计处理 按 Student 氏 t 测定, 数据以mean±SD表示。

2结果

2.1 RhIL-6对缺氧-复氧后海马神经元Bcl-2、Bax表达的影响

经Bcl-2和bax免疫组织化学显示,对照和rhIL-6组缺氧前海马神经元中均有Bcl-2和Bax表达, bcl-2和Bax蛋白分布于神经元胞体内，染色为浅紫色。缺氧2 h 海马神经元对Bcl-2和Bax的表达均较缺氧前增强, Bcl-2和Bax表达神经元均由浅紫色逐渐变成深紫色, 缺氧4 h和缺氧4 h复氧后24、72 h,海马神经元Bcl-2表达逐渐减弱, 但Bax表达逐渐增强。结果可见, 缺氧前对照和rhIL-6组神经元对Bcl-2、Bax表达的平均光密度和Bax/Bcl-2平均光密度比值经统计均无明显变化。缺氧2 h时神经元对Bcl-2 表达的平均光密度较缺氧前增强(P＜0.05)， 对Bax表达的平均光密度也较缺氧前增强，但无统计意义。 Bax/Bcl-2平均光密度比值经统计也无明显差异。缺氧4 h复氧后24、72 h, 海马神经元对Bcl-2表达的平均光密度较缺氧前明显减弱(P＜0.01), 对Bax表达的平均光密度较缺氧前明显增强(P＜0.01)， bax/Bcl-2平均光密度比值较缺氧前明显增大(P＜0.01)。经rhIL-6预处理的海马培养神经元缺氧4 h和复氧后24、72 h，Bcl-2表达较对照组增强, 但Bax表达较对照组减弱。分析的结果同样显示，rhI-6预处理组海马神经元缺氧4 h和缺氧4 h复氧后24、72 h，与对照组相比，Bcl-2表达神经元的平均光密度显著增强(P＜0.01)，Bax表达神经元的平均光密度显著减弱(P＜0.01)，Bax/bcl-2平均光密度比值显著减小(P＜0.01)。

2.3 RhIL-6对缺氧-复氧后海马神经元凋亡的影响

经TUNEL染色显示, 对照和rhIL-6 组缺氧前海马培养神经元中凋亡神经元所占百分率经统计无明显差异。凋亡神经元表面皱缩, 体积缩小,细胞核固缩并有时可见碎裂成数个圆形颗粒的小体。 缺氧2、4 h时凋亡神经元百分率与缺氧前相比经统计无明显差别, 但缺氧4 h 复氧后24和72 h,凋亡神经元百分率明显增多(P＜0.01)。 经rhIL-6预处理的海马神经元缺氧-复氧后24和72 h，凋亡神经元百分率较对照组明显减少(P＜0.01)。用流式细胞仪测定神经元凋亡的结果与用TUNEL法测定结果基本相似。

3讨论

近年来, 有关缺血缺氧性脑损伤与神经元凋亡及其有关基因调控的研究日益受到重视。人们发现, 脑缺血缺氧时除以往普遍认为的神经元坏死外,还存在另一种神经元死亡形式, 即神经元凋亡。 Iwai等[5]用TUNEL法在蒙古沙土鼠缺血再灌注模型中发现, 缺血再灌注72 h后,海马CA1区部分神经元出现DNA断裂。 Nitatori等[6]研究发现, 沙土鼠双侧颈总动脉夹闭 5 min 后1~3 d,在海马CA1区出现迟发性神经元死亡, 经TUNEL 法染色和电镜证明， 这些神经元的病理改变呈现出细胞凋亡的特点,说明短暂的非致死性的不完全脑缺血引起的迟发性神经元损害是细胞凋亡。 Copin等[7]报道缺氧可导致培养的神经细胞凋亡。在我们的实验中观察到, 与缺氧前相比,缺氧2、4 h时凋亡神经元百分率增加不明显。但缺氧4 h复氧后24、72 h时凋亡神经元百分率明显增多,表明缺氧-复氧后海马培养神经元凋亡与迟发性神经元损害有关。

目前已知有数种基因参与了神经元凋亡的调控。其中Bcl-2家属是目前研究得较为深入的与凋亡密切相关的基因, 包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax等。Krajewski等[8]应用心脏停搏造成脑缺血10 min, 在短暂缺血早期可见Bcl-2和Bax蛋白在神经元中表达, 缺血3 h后, 形态上发生变化的神经元Bcl-2 表达下降, 但Bax表达增强。Chen等[9]在全脑缺血实验动物模型上观察到, bcl-2仅在海马CA3区和齿状回存活的神经元上表达, 而 Bax 凋亡基因则在海马 CA3 区将死亡的神经元上表达, Bax/Bcl-2蛋白的比值决定着海马神经元受刺激后是凋亡还是存活。

本实验观察到, 培养12 d的海马神经元缺氧2 h时Bcl-2和Bax的表达均较缺氧前增强, 推测缺氧早期海马神经元Bcl- 2和Bax表达增强是缺氧的应激反应。但缺氧4 h复氧后24、72 h, 海马神经元对Bcl-2的表达逐渐减弱, 而对Bax的表达逐渐增强, Bax/Bcl-2比值逐渐增大。结果表明,缺氧-复氧后海马神经元Bcl-2表达减少、Bax表达增强、Bax/Bcl-2比值增大与缺氧-复氧后神经元的凋亡有关。

本实验还观察到, 经rhIL-6预处理的海马培养神经元与对照组相比<