摘要：为研究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的内毒素休克小鼠多种脏器中胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）表达的差异, 用5 mg/kg LPS腹腔注射小鼠后, 分别采用Western blotting 和RT-PCR法检测组织中ICAM-1蛋白和mRNA的表达情况。结果显示, 在正常小鼠, ICAM-1蛋白和mRNA的表达在肺中最多, 其次是脾脏, 在肾脏和肠有少量表达, 在肝脏和心脏中未能检出。LPS腹腔注射后6 h可诱导小鼠发生内毒素休克, 此时, ICAM-1蛋白表达仍以在肺中最多,在肝、脾、心、肾和肠依次减少；其中在肺、肾和脾分别比正常时增加4.5、3.0和1.5倍, 而且在正常时不能检出的肝和心中呈现阳性,但在肠中则变化不大。脏器中ICAM-1 mRNA亦相应显著增加。上述结果表明,在LPS诱导的内毒素休克小鼠的多种脏器中ICAM-1蛋白和mRNA表达显著增加。脏器间ICAM-1表达上调的差异可能带来内毒素休克时脏器的不同易伤性,抑制ICAM-1的表达可能对内毒素休克的防治有重要的意义。来自革兰氏阴性杆菌细胞壁的脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 是引发内毒素休克的关键因子,在内毒素休克病人的血浆中可达100~1000 ng/ml (正常人在10 ng/ml以下)[1,2]。LPS可以诱导内皮细胞胞间粘附分子1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）的表达[3], ICAM-1是白细胞上β2-整合素家族的重要受体,能促使白细胞粘附到内皮细胞。白细胞激活后释放的自由基、蛋白溶酶、及白三烯类物质可损害血管内皮和实质细胞, 参与多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的发生。现公认白细胞和内皮细胞之间的粘附作用所导致的组织损伤是细菌、内毒素和细胞因子等引发的 MODS的共同通路之一,在内毒素休克及MODS的发生发展中起重要作用。

本研究复制内毒素休克小鼠模型, 研究内毒素休克小鼠多种脏器中ICAM-1表达的差异, 探讨内毒素休克时机体脏器出现不同易伤性的机制,为内毒素休克的防治提供了一些线索。

1材料和方法

1.1 材料及试剂来源实验用无特殊病原体BALB/c雄性小鼠（10周龄, 20~22 g）由第一军医大学实验动物中心提供, lPS（来源于大肠杆菌055∶B5菌株）购于Sigma公司, 羊抗小鼠ICAM-1多克隆抗体和鼠抗羊IgG-HRP购自Santa Cruz公司, oligo(dT)12-18、M-MLV反转录酶和Taq DNA聚合酶分别购自Promega和宝生物公司, PVDF膜和RNA提取试剂Tripure购自Boehringer mannhein公司, PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 小鼠内毒素休克模型复制雄性BALB/c小鼠（n=3）采用戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉, 在立体分离显微镜（SMZ-1B, NIKON）下,把PE50聚乙烯管（Clay Adama, Piscataway,NT）插入一侧颈总动脉, 用4 道生理记录仪监视和记录血压。记录正常动脉血压后,小鼠腹腔注射LPS (5 mg/kg), 6 h后, 小鼠经摘眼球放血处死, 之后立即取出小鼠肺、心、肝、肾、肠和脾等组织, 液氮速冻, -70℃保存,用于Western blotting 和RNA提取。

1.3 ICAM-1蛋白检测组织中ICAM-1蛋白检测采用Western blotting[4]。取适量组织加入10倍体积的细胞裂解液,4℃制成匀浆。小部分样品采用Brodard法进行总蛋白定量, 其余样品加入等量2×SDS加样缓冲液, 样品经100℃煮沸5 min, 超声粉碎1 min,10000×g离心10 min, 上清经7％ SDS-PAGE凝胶分离, 每份样品上样50 μg总蛋白, 蛋白带半干电转移到PVDF膜上。PVDF膜室温下用TTBS阻断1 h；用一抗孵育2 h, TTBS洗涤3次；膜用二抗孵育1 h, TTBS洗涤3次；用化学发光法显示ICAM-1蛋白带, 以凝胶图像分析仪分析（Vilber lourmat, France）。

1.4 ICAM-1 mRNA表达的测定组织中ICAM-1 mRNA表达的测定用RT-PCR方法。用RNA提取试剂Tripure 按照厂家说明提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链, 反应体系为：5 μg总RNA, 0.2 μg oligo(dT)12-18, 100 U的M-MLV逆转录酶, 20 U的RNasin,加反转录缓冲液至总体积20 μl。37℃反应1 h, 95℃变性5 min。取反转录产物4 μl进行PCR反应（94℃变性1 min, 55℃复性1 min,72℃延伸1 min,30个循环）。扩增组织中ICAM-1（GenBank登录号：X52264）的引物为：5′-GACCACGGAGCCAA-TTTCTCA-3′ (563-583)和5′-TCCAGTTCCCCAAG- CAGTCC-3′(1263-1234), 片段长度为691 bp;扩增内对照GAPDH（GenBank登录号：NM_008084）的引物为：5′-CCCATCACCATCTTCCAGGA-3′(257-276)和5′-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3′(831-812), 片段长度为575 bp。PCR扩增产物用２％琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色显示, 凝胶图像分析系统分析, 以ICAM-1 mRNA／GADPH mRNA电泳带的荧光强度比值作为ICAM-1 mRNA的表达量指标。

2结果

2.1 内毒素休克小鼠的血压变化

正常小鼠平均动脉压为127.5±9.0 mmHg, 小鼠腹腔注射LPS (5 mg/kg) 10 min时降至102.8±6.8 mmHg, 30 min时回升至111.8±7.5 mmHg, 60 min 时再次下降至93.8±5.2 mmHg, 100 min 时持续下降至63.8±3.8 mmHg,220 min 时为52.5±4.5 mmHg, 300 min时为 51.0±3.0 mmHg. 在小鼠腹腔注射LPS后360 min,平均动脉压仅有42.0±3.0 mmHg, 提示LPS (5 mg/kg)剌激足以诱导小鼠内毒素休克的发生。

2.2 正常小鼠各种脏器中ICAM-1蛋白和mRNA表达的差异

正常情况下, 小鼠肺组织ICAM-1蛋白表达量最多, 其次是脾脏, 在肠和肾中也有极少量的表达, 在心和肝中表达量极微, 难以用化学发光法检测到。

用RT-PCR检测ICAM-1 mRNA的表达量灵敏度极高, 但只能进行半定量分析。本研究以ICAM-1 mRNA／GADPH mRNA比值代表ICAM-1 mRNA的表达量, 在正常小鼠肺组织中ICAM-1 mRNA／GADPH mRNA比值约为0.4, 脾脏两者比值为0.2, 在肾、心、肝和肠,两者比值在0.1~0.2之间。

2.3 内毒素休克小鼠各种脏器ICAM-1蛋白和mRNA表达的差异

小鼠发生内毒素休克时, 各种脏器的ICAM-1蛋白表达均有不同程度的增加。就绝对量而言, 仍以肺组织中ICAM-1表达量最多, 其次是肝和脾,心和肾中也有少量表达, 肠中ICAM-1的表达最少。与正常小鼠相比,肺组织中ICAM-1表达量增加4.5倍；脾脏增加1.5倍；肾脏增加3.0倍；肝脏和心脏的增加十分显著, 由于正常时未能检出,难以用增加的倍数表示；而肠中ICAM-1表达变化不大。肺组织的ICAM-1 mRNA/GAPDH mRNA比值约为2.5, 脾为1.0,两者与对照相比增加5～6倍, 在肾、肝、心和肠, 两者比值分别在0.2~0.5之间, 均有相应增加。

3讨论

多器官功能衰竭的发生常常是细胞-细胞间相互作用的结果, 其中内皮细胞不仅是炎症反应的参与者,而且还是首先受损的靶细胞。内皮细胞受损带来微血管的损伤和微循环的障碍,这可能是器官功能衰竭的始发环节之一。表达于内皮细胞表面的ICAM-1介导了中性粒细胞和内皮细胞的相互作用,这种相互作用可能导致内毒素休克时多种器官受到损害。研究表明, iCAM-1在LPS引起的肺、肾、肝等脏器的炎症损伤中起重要作用[5~7]。阻止ICAM-1的表达上调[7,8]或应用ICAM-1的抗体[9,10],可抑制或减轻LPS引起的多种脏器的损伤。可见, 多种脏器中ICAM-1的表达增加在LPS诱导的炎症或休克中起重要作用。

本研究查明, 在正常情况下, 固有ICAM-1蛋白表达量在肺最多, 其次是脾, 在肾和肠也有极少量表达,但在心脏和肝脏中难以检测到。尽管已知ICAM-1可表达于内皮细胞、肝细胞、单核细胞等多种细胞, 但以血管内皮细胞上的表达量最多。因此,不同脏器ICAM-1蛋白表达量的差异, 可能与脏器中血管比例多少有关, 尤其是与毛细血管和微静脉的多少有关。肺是微血管最为丰富的脏器之一,因此肺中ICAM-1的表达量最多。从脏器中ICAM-1 mRNA的表达量来看, 正常小鼠以肺组织最多, 脾次之,肾、心、肝脏最少。这进一步说明不同脏器组织转录表达ICAM-1的能力不同。

lPS注射后6 h, 小鼠血压由正常时的127.5 mmHg降至42.0 mmHg, 小鼠处于严重的内毒素休克状态。此时, ICAM-1蛋白的表达仍以肺最多,肝、脾、心、肾、肠的表达依次减少。心脏和肝脏表达的增加十分显著, 由正常时的检测阴性转为显著的阳性；肺、肾、脾分别比正常增加4.5、 3.0和1.5倍；而肠道变化不大。脏器中ICAM-1 mRNA的表达量也相应增加, 说明脏器中增多的ICAM-1蛋白来自ICAM-1基因的转录和表达。

文献报道, 肺组织中ICAM-1表达最多[11,12]。我们的实验也证明, LPS剌激引起内毒素休克时, 肺ICAM-1蛋白表达比正常高4倍,并显著高于其它脏器, 而且表达量在LPS刺激后3 h即可达高峰。ICAM-1表达的快速显著增加带来中性粒细胞的粘附、激活和释放,增加了肺损伤的易感性, 参与了内毒素休克时ARDS的发生。这也可能是MODS时肺最常先出现损害的重要原因之一。本文还证明, 发生内毒素休克时,正常未能检测到ICAM-1蛋白表达的心脏和肝脏呈现阳性, 而肾脏的表达比正常高3.0倍, 表达量达高峰时间多在LPS剌激后12～36 h 。由此带来内毒休克后期, 肠、心、肝、肾等多种器官功能受到损害。

总之, 本研究复制了内毒素休克小鼠模型, 发现LPS可显著诱导多种脏器ICAM-1蛋白和mRNA 的表达增加,但不同脏器间具有显著差异。这种差异可能是影响内毒素休克时哪种脏器先发生功能不全的一个重要因素, 并提示抑制ICAM-1表达上调可能对内毒素休克的防治有重要意义。

参考文献

[1]Ulevitch RJ,Tobias PS. Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol, 1995,13：437～457.

[2]Endo<