摘要：实验应用常规微电极方法研究了在生理温度下（36.5±0.5℃）降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)对豚鼠心房肌细胞复极过程的影响及其与钾电流的关系。结果表明：（1）CGRP（16 nmol/L）可拮抗由钾通道阻断剂BaCl2、 4-AP引起的动作电位时间延长。（2）CGRP（16 nmol/L）能够增加细胞外高钾（18.5 mmol/L）条件下心房肌慢反应动作电位的APA和Vmax,并缩短传导时间。（3）CGRP（16 nmol/L）能减弱甚至消除因并用CsCl (5 mmol/L)和无钾灌流液诱发的触发活动。（4）CGRP对动作电位复极过程的作用因温度条件而异。在生理温度下, cGRP(5、16和50 nmol/L)能够使动作电位平台抬高, 缩短动作电位复极化20%、50%和90%时程。其中,对动作电位复极化20%、50%时程的作用呈剂量依赖性。而在室温下（25.5±2.1℃）, CGRP使动作电位复极化20%、50%和90%时程延长。上述结果提示, cGRP对心房肌细胞具有多重电生理效应, 其中生理温度下CGRP对钾电流的促进作用在动作电位的改变中占重要地位, 今后有必要进一步研究CGRP对各种钾通道的作用。大量研究表明, 降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是一种非常重要的内源性心血管调节物质[1,2], 具有明显扩张动脉[3, 4]、 增加心率[3, 5~7]和增强心房肌收缩力[1, 5,6]的作用。此外, CGRP还有对抗某些类型心律失常的作用[8,9]。

应用膜片钳技术, 研究者一致认为CGRP可促进心房肌的钙内流[10, 11], 这一作用与其正性变时和变力作用符合。 有研究表明, CGRP可促进IK[10]和IK(ACh)[12],但对Ito[13]和IK1 [10]无作用。有关CGRP对心肌复极过程的影响, 结果差别甚大。据不同实验室报道, CGRP对心房肌动作电位时间（APD）的作用分别为明显延长[10]、轻度延长[1]和无改变[13]。然而,本室前文[7]曾报道, CGRP可增加窦房结起搏细胞的最大舒张电位和复极速度, 并缩短APD。作者推测, 造成CGRP对心肌APD作用的不同,除与标本类型和动物的种属差异有关外, 实验温度不同可能是一个重要原因。IK大小受温度影响很大[14], 尽管研究表明CGRP对心肌钙、 钾电流都有促进作用,但是如采用不同温度条件, 则可能导致内向和外向电流在量的变化对比上产生明显差异, 使得CGRP对APD的作用表现为延长或不变, 甚至缩短。基于这种考虑,本文应用普通微电极技术, 着重在生理温度下研究钾电流的变化在CGRP作用中的地位及CGRP对心房肌静息电位和动作电位的影响。

1材料和方法

1.1 标本制备实验用豚鼠32只, 体重290±10 g, 雌雄不拘(首都医科大学实验动物中心提供, 一级动物)。击昏动物后, 速取其心脏置于改良台氏液中,进一步制备左心房标本, 固定于1 ml灌流槽内。 台氏液经95% O2和5% CO2平衡后, 通过蠕动泵恒速（2 ml/min）灌流标本,实验时灌流温度除特别指出外, 均为36.5±0.5℃。

1.2 灌流液及药物台氏液成分为(mmol/L)：NaCl 135、 KCl 5.4、 CaCl2 1.8、 MgCl2 0.5、 NaH2PO4 0.33、 glucose 5.5、 HEPES 5, pH 7.4。实验所用药物有：CGRP(Peninsula Laboratories, Inc. USA)、4-AP(Sigma)、 BaCl2(北京化学试剂二厂)、 CsCl（有色金属研究总院）。所有药物均为分析纯,使用时按一定浓度（见结果部分）加入台氏液灌流标本。

1.3 实验方法Ag-AgCl刺激电极置于灌流槽, 贴近心肌。由刺激器（SEN-3301, 日本）经隔离器（SS-201J, 日本）输出方波（1 Hz, 波宽1 ms, 1.5倍阈电压）驱动标本。标本稳定1 h后开始实验。

实验采用标准微电极技术记录心房肌细胞动作电位(AP), 动作电位信号经微电极放大器（ISE-I,中国科学院上海生理研究所）输入微机化生理信号采集分析系统（NSA-III, 南京隆海科技实业公司）。本实验测量如下指标：静息电位（RP）、 0相最大上升速率(Vmax)、动作电位幅度(APA)、 动作电位复极化时程(APD20、 APD50、 APD90)。

1.4 数据处理实验中AP各项指标均以mean±SD表示, n为所观察的心房肌细胞数, 应用配对t检验进行统计分析。

2结果

2.1 CGRP对 4-AP和 BaCl2引起的AP变化的影响

实验观察到在分别以2 mmol/L 4-AP和10 μmol/L BaCl2灌流时, 对APA、 Vmax及RP无影响, 但可明显引起APD特别是APD90的延长,而加入16 nmol/LCGRP后可明显消除 4-AP和BaCl2延长APD的作用。停用CGRP后, 4-AP和BaCl2的作用重现。

2.2 CGRP对心房肌慢反应动作电位的影响

用高钾台氏液（KCl为18.5 mmol/L）灌流心房肌标本, 随即出现RP减小, APA、 Vmax降低以及传导时间延长, 3 min左右达稳态,出现稳定的慢反应动作电位。此时用含16 nmol/L CGRP的高钾台氏液灌流, 30 min时可以使RP增加, APA、 Vmax增大,传导时间缩短。在六个心房肌细胞重复观察获得了相同的结果。

2.3 CGRP对实验性心律失常的影响

用含5 mmol/L CsCl的无钾台氏液灌流标本, 随即出现RP减小, APA、 Vmax降低以及APD延长, 20 min左右出现触发活动, 30 min时加入16 nmol/L CGRP, 约5 min后可部分或全部抑制触发活动。

2.4 不同温度下CGRP对心房肌细胞动作电位的影响

考虑到某些钾通道受温度影响很大, 实验观察了三个浓度CGRP（5、 16、 50 nmol/L）在不同温度下对心房肌细胞AP的影响。36.5±0.5℃时, cGRP使心房肌细胞AP平台抬高, RP、 APA、 Vmax增加, APD20、 APD50和APD90缩短。其中, CGRP对RP、 APD20、 aPD50的作用呈剂量依赖性。 25.5±2.1℃时, CGRP也使RP、 APA、 Vmax增加, 但使动作电位复极化20%、 50%和90%时程延长。

3讨论

动作电位复极相是内向与外向电流综合作用的结果, 任何因素只要影响到内向和外向电流的消长关系, 都会影响复极过程。反之,复极速率及时程的变化也提示内向与外向电流对比关系发生了改变。CGRP对心房肌细胞离子通道具有广泛的作用。已有文献肯定CGRP可促进钙内流, CGRP对心房肌钾通道的作用仅有少量报道。而CGRP对心房肌动作电位影响的研究则更是缺少, 而且结果不一[1, 10, 13]。基于这一状况,本文特别强调在生理温度下研究CGRP对心房肌细胞动作电位各参数的影响及钾通道在CGRP作用中的地位。3.1 钾通道阻断剂与CGRP的作用

为探讨CGRP可能作用于某些类型钾通道, 本文分别在应用Ito阻断剂（4-AP 2 mmol/L）和IK1阻断剂（BaCl2 10 μmol/L）的基础上,观察CGRP对心房肌AP的影响。 发现4-AP延长APD20、 APD50和APD90, 而BaCl2主要延长APD90, 这些作用均可被16 nmol/L的CGRP所逆转。说明CGRP对Ito和IK1都有作用。然而, ono认为CGRP对IK1没有作用[10]。此外, 文献中未见相关报道。3.2 高钾条件下CGRP的作用

本文还应用细胞外高钾液先造成心房肌慢反应电位, 然后进一步观察CGRP对膜电活动的影响, 发现CGRP可逆转因细胞外高钾导致的静息电位、0期幅度和上升速率的下降。如前所述, CGRP有增加心房钙电流和促进复极、 增加静息电位的作用, 而静息电位的增加可促使心肌由慢反应电位逆转为快反应电位,如果完全用CGRP对钙、 钾电流的影响来解释, 似乎有些牵强。另一种可能是CGRP促进氯离子内流导致静息电位增加, 理由是：（1）高钾条件下, 钾平衡电位下降,但氯离子平衡电位(约－90 mV)未变; （2）心肌存在一种cAMP依赖性氯电流; （3） CGRP可增加心肌细胞内cAMP水平。由此看来,有必要深入探讨这一现象。3.3 CGRP与心肌触发性活动

据报道, CGRP 可削弱由强心甙[8]、 乌头碱或缺血/再灌注诱发的心律失常, 但其机制至今未完全阐明。本实验采用含有CsCl（5 mmol/L）的无钾灌流液诱发触发性活动,发现CGRP增加复极速率和静息电位, 同时消除触发性活动。这一作用与CGRP促进钾外流一致。3.4实验温度条件对CGRP作用的影响

尚未见到有关温度条件影响CGRP作用的文献。Ohmura 曾报告CGRP仅轻微引起心房肌超极化, 而不影响动作电位其它参数, 但文中未提及实验温度[13]。 ono等在室温下发现CGRP使心房肌APD明显延长[10]。 本室以前的工作曾发现, 在35℃ 条件下, CGRP促进窦房结0期上升幅度和速率,同时还加速其复极过程[7]。据文献报道, IK大小与记录时的温度关系极大, 而钙电流对温度相对不敏感[14]。为此, 本研究在两个温度下, 比较了CGRP对AP各参数的影响,实验中发现, CGRP在室温下使APD延长而在生理温度时使APD缩短。这说明CGRP在生理温度下对心肌钾通道的作用是不容忽视的。作者认为其中原因可能是CGRP在低温下对钙电流的影响突出,而在较高温度时对钾电流的作用明显上升。另外, 值得注意的是, 在两种温度下, CGRP都使静息电位、 动作电位幅值和上升速率增加。本文中CGRP对静息电位的影响与Ohmura的报告一致[13], 而对动作电位幅值和上升速率的影响与裴建明的符合[15]。作者推测CGRP 可能通过增加静息电位或其它途径影响钠电流,然而文献中尚未见到类似报道。

综上所述, CGRP对心房肌细胞具有多重电生理效应, 其中在生理温度下CGRP对钾电流的促进作用在CGRP的作用中占重要地位, 今后有必要进一步研究CGRP对各种钾通道的作用。

参考文献

[1]Ishikawa T, Okamura N, Saito A, Masaki T, Goto K. Positive inotropic effect of calcitonin gene-related peptide mediated by cyclic AMP in guinea pig heart. circ Res, 1988, 63: 726~734.

[２]Gulbenkian S, Saetrumopgaard O, Ekman