摘要：为筛选血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)与肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)间表型转化有关的基因,实验建立了大鼠胸主动脉AF和MF两种细胞模型, 用差异显示聚合酶链反应(DDPCR)技术获得表达差异片段, 对差异片段进行克隆和测序分析, 并用定量PCR和Northern blot对差别显示结果进行验证。用反义核酸转染技术观察骨桥蛋白(osteopontin, OPN)对AF迁移的影响。 结果表明,两种表型细胞存在明显的基因表达差异, 其中一个在MF下调的差异片段与GenBank 中NADH脱氢酶亚单位5 (NADH dehydrogenase subunit 5, Nd5)基因高度同源。另一个在MF上调的差异片段与OPN基因同源。上述差异表达结果被定量PCR及Northern blot证实。此外还有4个表达序列标志(expressed sequencetag, EST)在GenBank中未查到同源序列。反义OPN寡脱氧核苷酸可抑制AF的迁移活动。结果提示, aF转化为MF可能与ND5基因下调、 OPN上调及其它未知基因的表达改变有关。应用反义技术适度抑制OPN表达在防治血管重塑中具有重要作用。在球囊扩张等机械性损伤刺激下, 血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)被迅速激活, 并转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, mF)。MF兼有AF及血管平滑肌细胞(VSMC)的双重功能特性, 它能产生细胞外基质(ECM)和多种生物活性因子, MF增殖并迁移至中膜及内膜,从而在血管重塑中起重要作用［1］。我们曾报道在体外培养条件下用转化生长因子β1(TGFβ1) 诱导AF转化为MF［2］,为研究外膜细胞在血管重塑中的作用和机制提供了合适的细胞模型。近年来有关MF与血管重塑关系的报道日益增多,但对AF转化为MF的分子机制尚不了解。本研究采用差异显示聚合酶链反应(DDPCR)技术, 筛选出与AF转化为MF有关的基因。

1材料和方法

1.1 AF及MF两种表型细胞的建立及鉴定采用贴片法获得并培养WKY大鼠胸主动脉外膜的AF细胞, 实验使用3～5代细胞［3］; 用TGFβ1 (20 ng/ml)处理静止状态的AF细胞24 h后获MF。采用免疫细胞化学技术及透射电镜对AF和MF进行细胞表型鉴定。WKY大鼠由上海市高血压研究所提供, TGFβ1购自Valbiotech 公司。

1.2 总RNA提取及逆转录反应用Trizol试剂(Gibco公司)分别提取AF及MF两种细胞的总RNA量。各取0.2 μg RNA,用Beckman公司差异显示试剂盒的3′末端12个锚定引物合成cDNA第一链。

1.3 差异显示PCR两种细胞的逆转录产物分别与试剂盒5′末端20个随机引物配对, 进行PCR扩增 (每一组实验选2个锚定引物与8个随机引物配对,共32个反应)。反应总体积为10μl, 内含1×buffer, 3.75 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNTP、荧光锚定引物和随机引物各0.35 μmol/L、 1 μl 逆转录产物、 0.05 U/μl高保真Taq DNA聚合酶。反应程序: 95℃2min,１个循环; 92℃ 15 s、 50℃ 30 s、 72℃ 2 min, 4个循环; 92℃ 15 s、 60℃ 30 s、 72℃ 2 min, 30个循环;72℃延伸7 min, 4℃保存。

1.4 分离差异片段配制5.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶, 长61 cm, 宽33 cm。扩增产物加荧光染料变性处理后, 经Genomyx LR电泳仪上样及Genomyx sC荧光成像系统扫描仪(Beckman公司)获取图像, 显示差异片段。

1.5差异片段的回收及再扩增经割胶系统(Beckman公司)切割差异片段凝胶, 用T7及M13引物(Beckman公司)对差异片段再扩增, 然后用QIAquick gel 抽提试剂盒(QIAGEN公司)纯化扩增产物。

1.6 再扩增产物的克隆及序列分析将纯化产物连接到pMD18T载体(Takara公司), 转染DH5α感受态细胞, 经平板筛选单克隆, 扩增后抽提质粒DNA,然后酶切鉴定。用末端荧光标记法进行DNA序列分析。所获测序结果通过Blast软件与GenBank收录序列进行同源性比较。

1.7定量PCR使用离心式定量PCR仪(Corbett 公司), 用SYBR Green荧光染料(Molecular Probes公司)标记双链DNA,通过实时检测DNA扩增测定模板的拷贝数。引物合成根据差异片段的测序结果。NADH脱氢酶亚单位5(NADH dehydrogenase subunit 5, nd5)基因上游引物5′GGT~AA~GGG~CTA~GGC~TTCC~GA3′, 下游引物5′CCA~CCCC~CTAA~CCTC~AAA~CAA3′;骨桥蛋白(osteopontin, OPN)基因上游引物5′GCT~TG~GCT~TAT~GGA~CTG~AGGT3′, 下游引物5′AC~GAA~GTT~TCA~CAG~CCA~TGAG3′。将PCR反转录产物分别稀释104、106、 108和1010倍, 用这些稀释产物制备标准曲线。PCR反应总体积20 μl, 含RT产物0.5 μl, 1×buffer, 0.25 mmol/L dNTP, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.06 U/μl Taq酶, 引物各0.25 μmol/L, 荧光染料2 μl。反应程序: 92℃ 15 s,60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 35个循环。结果以mRNA拷贝数表达。

1.8 Northern blot鉴定［4］取RNA 30 μg, 经1%琼脂糖变性电泳后, 用虹吸法将变性RNA转移至尼龙膜(Sigma公司)。以OPN、 nD5再扩增产物为探针, 用［α~32P］dCTP标记(Takara公司), 并纯化之(QIAGEN公司)。杂交, 常规洗膜,-70℃放射自显影。以图像分析仪(复日Smart View 2000)测定各杂交带光密度值与面积。

1.9人工合成OPN寡脱氧核苷酸由德国Tech Dragon Limited公司合成硫代修饰的OPN寡脱氧核苷酸。OPN反义核酸序列为5′AA~CCAC~TGCC~AGTC~TCAT3′,正义核酸序列为5′ATG~AGA~CTG~GCA~GTG~GTT3′, 错配义核酸序列为5′AA~CTA~CTAT~CAGT~CTC~GT3′。

1.10转染核酸/脂质体基础上的细胞迁移实验采用AF接种Transwell(Corning公司)下室, 约70%～80%融合后, 去血清同步48 h,以含1.5 μmol/L反义OPN/脂质体的DMEM培养液预处理8 h, 继以行TGFβ刺激。另设空白对照组, 单纯TGFβ刺激组, 正义、 错配义OPN/脂质体组。TGFβ刺激24 h后, 在Transwell上室滴加1×105 AF悬液, 37℃温箱孵育2 h后取出上室, 棉签拭去室内AF, 对室膜外滤膜上细胞用4%多聚甲醛固定、染色。随机取5个视野(×200)计数取均值。

2结果

2.1细胞表型鉴定

免疫细胞化学, 经TGFβ1处理的细胞中, 平滑肌α肌动蛋白(αSMactin)表达阳性, 胞浆中见大量微肌丝; 而在未经TGFβ1处理的AF细胞,则αSMactin表达呈阴性。 透射电镜, 经TGFβ1处理的细胞, 胞膜下有大量微肌丝形成, 且胞浆内见到丰富的内质网; 未经TGFβ1处理的AF细胞,胞膜下几乎无微肌丝。

后显示, 插入片段与原测序胶的片段大小相似, 表明所有的差异片段均已克隆到载体中。

2.3差异片段的序列分析

测序结果与GenBank已知DNA序列进行同源性比较, 其中一个在MF中下调的差异片段(800 bp),其序列与ND5基因序列呈98%同源性。另一个在MF中上调差异片段(900 bp), 与OPN基因存在96%的同源性。此外, 4个表达序列标志(expressed sequencetag, EST) 在GenBank中未查到同源序列。把这些EST与dbEST库进行比较, 从中找出部分重叠的大鼠ESTs, 经Autoassembler软件将其组装成Contig序列,然后通过DNA Strider软件对电子克隆结果进行分析, 发现这几个EST不存在完整的开放阅读框。

2.4定量PCR检测

nD5基因在AF中表达量为246.33±35.64, 在MF中表达量为86.66±10.96(n=3, p＜0.01)。OPN在MF中表达量为1875.67±42.45, 在AF中表达量为211±53.39(n=3, P＜0.01)。

2.5Northern blot分析

nD5基因在AF中表达高于MF; OPN在MF中表达高于AF。

2.6．反义核酸对AF迁移活动的影响

反义核酸组AF迁移数目明显低于单纯TGFβ1刺激组(n=3, P＜0.01)。正义核酸及错配义核酸组AF迁移数目与单纯TGFβ1刺激组比较无显著性差异。

3讨论

多年来, 血管重塑的研究焦点都集中于血管内膜细胞及中膜VSMC。而晚近研究发现, 血管外膜细胞同样起作用, 特别是外膜AF在各种病理性损伤刺激下转化为MF,后者增殖及迁移, 参与了血管新生内膜的形成, 在血管再狭窄等血管病变的发生和发展中起重要作用［5］。

mF是一种具有平滑肌细胞特征的成纤维细胞, 其特征性结构是胞浆内含平滑肌α肌动蛋白。MF主要由组织局部AF转型而来, 可产生ECM和多种因子, 在器官发育、组织修复中起重要作用［6］。在众多的MF分化调控因子如PDGF、 GMCSF中, TGFβ被认为是MF表型的直接诱导因子,因为它上调平滑肌α肌动蛋白的表达［7］。

本实验免疫细胞化学和透射电镜检查结果显示, AF细胞经TGFβ1刺激后, 细胞内出现平滑肌α肌动蛋白和大量微肌丝,这些特征表明AF细胞已发生表型改变成为MF。在成功地建立血管的两种不同表型细胞模型的基础上, 我们从细胞表型转化这一功能入手, 分离和克隆与之有关的基因。

1992年以来, 差别显示聚合酶链反应 (DDPCR) 技术已被广泛用于不同组织或细胞间基因表达谱的比较研究。作为一种差异表达基因的筛选技术, 它有快速、有效的优点, 其产生的条带几乎可覆盖一个细胞所有基因的mRNA表达产物［8］。但在早期应用中, 该技术存在假阳性率高、 重复性较差等缺点。本实验使用的Genomyx电泳仪和荧光差别显示分析系统,具有分辨率高、 重复性好、 快速、 高通量等优点, 可将感兴趣的DNA片段在计算机上定位后准确割胶, 其假阳性率远低于传统的DDPCR技术。尽管如此,我们还采用了定量PCR和Northern blot 两种技术, 对DDPCR结果进行验证, 从而保证了结果的可靠性。

血管重塑