摘要：用福尔马林致痛模型、c -fos基因免疫组织化学法和NADPH-d组织化学技术,研究大鼠脊髓结构对福尔马林痛刺激的反应及异丙酚在其调节过程中的影响。结果表明,福尔马林痛刺激后,刺激侧脊髓背角出现大量Fos免疫样阳性神经元,其中部分为FLI/NOS双标记神经元;痛刺激之前或之后给予异丙酚,背角各层FLI神经元和FLI/NOS双标记神经元的数量均显著减少(P＜0.05 或P＜0.01);单纯腹腔注射异丙酚或生理盐水,脊髓未见或偶见FLI神经元。上述结果提示：异丙酚的抗伤害作用可能与其抑制了脊髓内NOS阳性神经元的活性有关。

异丙酚是临床常用的静脉麻醉药。临床及动物实验[1,2]均表明,它单独及复合其它麻醉药均可抑制伤害性刺激引起的运动反应。静脉输入的全麻药可能主要作用于中枢神经系统,并且有一定的选择性,但对其在中枢神经系统的确切作用部位仍有争议[3]。异丙酚是否通过影响脊髓水平的伤害性信息传递而发挥抗伤害作用,目前尚不清楚。机体受到外界伤害性刺激所诱发的cc-fos主要在与痛觉传递有关的神经元细胞核内表达,其表达产物Fos可作为伤害性感受神经元兴奋的标志物[4], 已广泛应用于痛觉的研究。

无机气体小分子一氧化氮 (nitric oxide, NO) 是一种新的重要神经信息物质。 许多实验[5~8]表明, nO在脊髓水平主要参与痛觉过敏的形成和发展, 在一些伤害性刺激条件下, NO可作为第二信使诱导Fos表达[9]。而NO是否参与了异丙酚对痛信号的转导或调控尚不清楚。现已证实, nADPH-d染色是一种标记NOS的特异方法[10]。本实验应用c -fos免疫组织化学法和NADPH-d组织化学技术, 观察了异丙酚对福尔马林诱导的大鼠脊髓内NOS阳性神经元Fos蛋白免疫反应的影响,以探讨异丙酚在脊髓水平伤害性信息传递或调制中的可能作用。

1材料和方法

1.1 材料和试剂SD大鼠30只(200～250 g), 雌雄兼用, 由徐州医学院实验动物中心提供。异丙酚系英国捷利康公司产品, 兔抗c -fos抗体, aBC试剂盒由美国Vector公司生产, β-NADPH为美国Sigma公司产品, 氯化硝基四氮唑蓝为美国Fluka公司产品。其他试剂至少为分析纯。

1.2 分组实验前, 动物在同一环境(室温15～20℃, 避免强光及噪音刺激, 足够的食物和饮水)饲养48 h以上。实验处理时,尽量避免额外刺激。大鼠随机分为六组(各组雌雄比例相同)：(1)单纯福尔马林(2.5%, 100 μl)一侧前爪掌心皮下注射、 刺激1 h大鼠6只(F组)；(2)福尔马林痛刺激10 min后腹腔注射(i.p.)100 mg/kg异丙酚1 h大鼠6只(FP组)；(3) i.p.异丙酚10 min后再行福尔马林痛刺激1 h大鼠6只(PF组)；(4) 单纯i.p.同等剂量异丙酚1 h大鼠6只(P组)。(5)福尔马林痛刺激10 min后i.p.等量(10 ml/kg)的生理盐水1 h大鼠3只(FS组)；(6)单纯i.p.等量的生理盐水1 h大鼠3只(S组)。

1.3 Fos免疫组织化学及NADPH-d组织化学技术反应动物经实验处理后, i.p.戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉, 开胸、 暴露心脏,经左心室灌流固定：先用100 ml生理盐水快速灌流冲洗血液, 继以4%多聚甲醛400 ml (0.1 mol/L PB, pH 7.4)持续灌注1 h左右。取脊髓C7-8(前爪感觉神经进入脊髓处), 在4%多聚甲醛中后固定2 h, 而后放入20%蔗糖(0.1 mol/L PB, pH 7.4)中,置于4℃冰箱过夜, 冰冻冠状连续切片, 片厚40 μm, 收集于0.01 mol/L PBS液(pH 7.4), 切片按序间隔分为Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ套。Ⅰ套切片以ABC法作c -fos免疫组织化学反应。具体步骤如下：(1)切片在0.01 mol/L PBS液(pH 7.4)漂洗10 min；(2)入5%正常羊血清(0.01 mol/L PBS液稀释), 室温30 min；(3)入兔抗c -fos一抗血清(1∶1000, 0.01 mol/L pBS液稀释), 37 ℃孵育2 h, 继以4℃孵育48 h；(4)入生物素标记的羊抗兔IgG二抗(1∶200, 0.01 mol/L PBS液稀释), 37℃孵育2 h；(5)入A、 B复合液三抗(1∶200, 0.01 mol/L PBS液稀释)， 37 ℃孵育1 h；(6)用0.05% DAB/0.03% h2O2呈色, 室温5～15 min。一抗、 二抗、 三抗和DAB显色后均用0.01 mol/L PBS洗10 min×3次。Ⅱ套切片作c -fos抗体替代实验,用0.01 mol/L PBS或正常羊血清替代兔抗c -fos一级抗体检测其抗体特异性, 其余步骤同上。Ⅲ套切片先作c -fos免疫组织化学染色,继作下列步骤的NADPH-d组织化学技术反应。具体步骤：(1)切片入0.2% Triton X-100、 0.6 mg/ml 氯化硝基四氮唑蓝和0.5 mg/ml β-NADPH 反应液(0.1 mol/L PB, pH 7.4), 37℃孵育40～60 min； (2)切片入0.01 mol/L pBS液(pH 7.4)漂洗5 min×3次。常规裱片、 脱水、 透明、 封片, 光镜观察、 记数并照相。

1.4 细胞计数和定量分析以上切片镜下可见有三种细胞：Fos免疫样(Fos-like immunoreactive, FLI)阳性神经元、 NOS阳性神经元及NOS/FLI双标神经元。FLI神经元表现为细胞核呈棕黄色,而胞浆不着色；NOS阳性神经元的胞体和突起呈蓝色, 而胞核不着色；NOS/FLI双标神经元表现为胞体和突起呈蓝色, 内有一棕黄色的细胞核。无论染色深浅,只要显示有NOS、 FLI及NOS/FLI阳性神经元的特征, 在低倍和高倍镜下与背景区分明确, 即予以计数。每只大鼠随机取脊髓切片10张。依Rexed分层法将脊髓灰质分成10层,进一步将脊髓灰质分为4个区来定量计数细胞数量：(1)浅层(Ⅰ、 Ⅱ层)；(2)固有核(Ⅲ、 Ⅳ层)：(3)颈部(Ⅴ、 Ⅵ层)；(4)底部(Ⅶ、Ⅹ层)。所有数据均以mean±SD表示, 组间比较应用Student's t检验, 以P＜0.05作为判断差异显著性的标准。

2结果

f组及FS组: 大鼠一侧前爪掌心皮下注射福尔马林后, 出现躁动不安、 嘶叫, 舔、 咬、 抓注射爪等痛反应, 注射爪红肿。痛刺激侧脊髓背角内可见大量FLI阳性细胞,对侧背角内有少量FLI阳性细胞散在分布。在痛刺激侧背角, 大多数FLI阳性神经元分布于 Ⅰ 层及 Ⅱ 层外带的内侧部；中等量散在分布于 Ⅴ层；少量分布于Ⅱ层腹侧部、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅶ和Ⅹ 层 (表1, 图1A)痛刺激侧脊髓背角部分FLI阳性细胞同时呈NOS阳性, 双标记神经元主要分布于 Ⅰ 层及 Ⅱ层的内侧部；其它各层及对侧少见或偶见双标记细胞。

pF组: 大鼠注射异丙酚后数分钟内翻正反射消失, 10 min后再皮下注射福尔马林时, 注射爪红肿, 但大鼠无明显痛行为表现, 而呈持续睡眠状态,所有大鼠至灌注时翻正反射仍未恢复。大鼠脊髓 FLI细胞的分布与F、 FS组相比基本相似, 但镜下可见痛刺激侧脊髓背角各层FLI阳性细胞显著减少, 与F、 fS组相比差异显著(P＜0.01)；痛刺激对侧几无FLI阳性神经元。脊髓双标记细胞明显减少, 与F、 FS组相比差异显著(P＜0.01)。

fP组: 大鼠注射福尔马林后早期行为变化同F组, 但i.p.异丙酚后数分钟内翻正反射消失, 不再有明显的痛行为表现, 而呈持续睡眠状态,所有大鼠至灌注时翻正反射仍未恢复。FP组大鼠FLI阳性神经元的分布与F组基本相似, 但痛刺激侧脊髓背角各层FLI阳性细胞显著减少, 与F、 fS组相比差异显著(P＜0.05 或P＜0.01)；在Ⅰ、 Ⅱ层与Ⅶ、Ⅹ层较PF组显著增多(P＜0.05 或P＜0.01)脊髓双标记细胞明显减少, 与F、 fS组相比差异显著(P＜0.01)；与PF组相比无显著差异(P＞0.05)。

p组: 大鼠注射异丙酚后数分钟内翻正反射消失呈持续睡眠状态, 所有大鼠至灌注时翻正反射仍未恢复。脊髓背角各层未见或偶见FLI阳性细胞, 未见NOS/FLI双标记细胞。

s组: 大鼠无明显的行为变化。脊髓未见或偶见FLI神经元, 未见NOS/FLI双标记细胞；抗体替代实验未见c -fos表达。

3讨论

福尔马林实验是模拟临床急、 慢性炎症痛的良好模型[11],目前普遍应用于研究疼痛机制及评价镇痛药的实验[12]。Fos蛋白可作为神经元参与刺激信号传导和调控的一种标志[4]。本实验中, 福尔马林痛刺激诱发的FLI阳性神经元主要分布于同侧脊髓背角Ⅰ、Ⅱ、 Ⅴ层, 说明这些神经元参与了化学性致痛信息的传导和调控。这一部位与传递外周伤害性信息的初级传入纤维的终止区及背角痛敏神经元的分布区一致[13,14]；也与电生理记录的对伤害性刺激反应的背角神经元的分布部位相重叠[15], 提示背角Fos阳性神经元很可能介导痛觉信息传递。

痛刺激之前或之后给予异丙酚均可减少FLI阳性神经元的数量, 而异丙酚本身并不诱导脊髓内神经元的c -fos表达,说明异丙酚可能通过抑制与痛信息的传导和调控有关的脊髓背角FLI神经元的活动, 阻止痛信息在脊髓内的传导,从而产生抗伤害作用。有研究[16]表明：异丙酚可减少脊髓背角神经元对伤害性及非伤害性刺激感受野的面积,提示对外周的传入有抑制作用。Wang等[17]在断脊髓大鼠的实验中观察到异丙酚可明显抑制肌电C反应。这些发现与本研究结果一致。提示脊髓背角是异丙酚的重要作用部位,异丙酚有可能直接作用于脊髓， 或通过对脊髓上中枢的下行调制系统的影响而发挥抗伤害作用。

疼痛之前或之后i.p.异丙酚, 虽可明显抑制大鼠的痛行为表现, 但脊髓中仍有一定数量的Fos表达,表明临床全麻深度的异丙酚并不能完全抑制脊髓水平的伤害性信息的传递。疼痛前i.p. 异丙酚对痛刺激所致Fos表达的抑制作用强于痛刺激后给药,提示预先给药抗伤害效果可能更好, 即异丙酚可能有超前镇痛作用。

有研究[18]表明, 异丙酚可抑制数个不同脑区NOS的活性, 减少NO与cGMP的生成,表明NO在异丙酚的作用机制中可能发挥重要作用。但这些实验均以翻正反射的消失作为产生麻醉状态的指标, 只能说明NO与异丙酚的睡眠作用有关,未能进一步探讨其与异丙酚抗伤害作用的关系。本实验观察到, 给予福尔马林痛刺激后, 脊髓背角出现了许多FLI/NOS双标记神经元, 提示在痛刺激条件下这些NOS阳性神经元的兴奋性增强,它们产生的NO可参与化学性致痛信息在脊髓内的转导或调控, 与疼痛密切相关。异丙酚可减少痛刺激所<