摘要：实验采用标准玻璃微电极细胞内记录技术记录心肌细胞动作电位(action potential, AP)、 肌力换能器记录心肌收缩力(force contraction, Fc), 研究乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)对离体豚鼠心房肌、 心室肌的作用。结果表明, 10 μmol/L ACh可缩短心房肌、心室肌动作电位的时程(action potential duration, APD)。 心房肌APD在给药前后分别为208.57±36.05 ms及101.78±14.41 ms (n=6, P＜0.01), 心室肌APD在给药前后分别为286.73±36.11 ms及265.16±30.06 ms(n=6, P＜0.01)。 心房肌动作电位的幅度 (action potential amplitude, APA)也降低,给药前后分别为88.00±9.35 mV及62.62±20.50 mV (n=6, P＜0.01), 而心室肌APA无明显变化。ACh还降低心房肌、心室肌的收缩力, 心房肌、 心室肌Fc的抑制率分别为100% (n=6, P＜0.01)和37.57±2.58% (n=6, P＜0.01)。ACh对心房肌、心室肌APD和Fc的抑制作用在一定范围内(1 nmol/L~100 μmol/L)随ACh浓度的增高而增强。用Scott法求出ACh对心房肌、 心室肌APD缩短作用的KD值,分别为0.275和0.575 μmol/L, 对Fc抑制作用的KD值分别为0.135和0.676 μmol/L。各浓度下ACh对心房肌效应与心室肌效应作组间t检验,从10 nmol/L到0.1 mmol/L均有显著的统计学差异。此外, 10 μmol/L阿托品及20 mmol/L CsCl可阻断10 μmol/L ACh对心室肌APD的缩短作用,而0.1 mmol/L CdCl2对ACh所致心室肌APD的缩短作用影响不大。上述结果提示, ACh对心房肌、 心室肌APD及Fc均有不同程度的直接抑制作用,并随所用ACh浓度的增大而增大, 心房肌对ACh的反应较心室肌更为敏感。ACh对心室肌APD的缩短作用与毒蕈碱型胆碱受体(muscarinic receptor, MR)及K+电流关系较为密切, 而与Ca2+电流可能关系不大。自主神经在心脏活动的调节中起重要作用, 交感和副交感神经对心脏的作用存在部位差异性。交感神经支配心脏的各个部分,而副交感神经主要支配除心室外的其余部分[1]。已知ACh是副交感神经末梢释放的神经递质,它对心脏的作用可分为直接作用及间接作用两种。前者通过降低已被交感胺激活的腺苷酸环化酶 (AC)的活性, 进而降低环磷酸腺苷 (cAMP)含量实现的,可见于心脏各个部位; 后者通过直接激活毒蕈碱型钾通道 (K(ACh)通道)实现, 主要见于除心室外的其余部分。上述两种作用均由毒蕈碱型胆碱受体 (muscarinic receptor, MR)及鸟苷酸调节蛋白 (G蛋白)介导。但随着免疫学以及分子生物学的发展, 有人发现心室上可能有副交感神经及MR分布,尽管其含量明显少于心房[2, 3]。 本研究采用标准玻璃微电极及肌力换能器分别从组织细胞水平观察ACh对离体豚鼠心室肌有无直接作用及作用机制,并与心房肌进行对比, 为进一步阐明自主神经对心脏活动的调节机制提供理论依据。

1 材料和方法

豚鼠 (雌雄不拘, 200~250g)。击昏后取出心脏, 置于充氧加温的改良台氏液中。心脏可自行跳动, 利于排出心腔内残血。

改良台氏液成分 ( mmol/L): NaCl 147.00、 KCl 5.40、 MgCl2·6H2O 1.05、 Tris 10.00、 CaCl21.80、 glucose 11.10 (用HCl及NaOH调pH值至7.40±0.05), 实验当日新鲜配置, 仅供当日使用。

小心切取心耳及心室乳头肌并固定于灌流槽中, 用100%氧饱和的改良台氏液恒温 (36±0.5℃)恒速 (10 ml/min)灌流,台氏液pH值保持在7.2~7.4之间。稳定标本1 h, 待心肌电生理特性恢复后进行实验。

以波宽2 ms、 1.5倍阈强度的刺激电压驱动标本, 以内充3 mol/L KCl的玻璃微电极 (阻抗10~30 MΩ)通过微电极放大器 (MEZ-8201,日本光电)记录心肌细胞动作电位 (AP), 并通过肌力换能器记录心肌收缩力 (Fc), 结果分别进入微机医学信号处理系统 (RM-6281,由第四军医大学及成都仪器厂联合研制)及LMS-2A型二道生理记录仪。

数据以mean±SD表示, 统计学方法采用配对及组间t检验, 取P＜0.05为有统计学意义。用Scott法做量效曲线回归直线Y=a+bX,并求半数最大效应浓度(KD)值。

2 结果

2.1 ACh对心房肌、 心室肌AP的直接作用

标本稳定1 h后, 在频率为1 Hz的刺激下引出心房肌AP。记录给药前正常对照, 加入10 μmol/L ACh。可见标本兴奋性降低, 所需刺激强度逐渐增加, aP各参数明显缩短, 其中动作电位时程 (action potential duration, APD)在给药前后分别为208.57±36.05及101.78±14.41 ms (n=6, P＜0.01)。同时心房肌动作电位幅度 (action potential amplitude, APA)也明显降低,给药前后分别为88.00±9.35 及62.62±20.50 mV (n=6, P＜0.01) 。洗去ACh后10 min,心房肌AP各参数恢复至给药前水平。心室肌AP记录方法同心房肌。心室肌AP同心房肌的相比, 平台期显著, APD较宽。相同浓度ACh使心室肌标本兴奋性降低,所需刺激强度逐渐增加。APD各参数缩短, 其中APD给药前后分别为286.73±36.11 及265.16±30.06 ms (n=6, P＜0.01), 而APA变化不明显。洗去ACh后20 min, 心室肌AP各参数恢复至给药前水平。

2.2 ACh对心房肌、 心室肌Fc的直接作用

实验前先用1 g砝码定标, 换算出收缩幅度为10 mm时Fc为5 mN。在频率为1 Hz的刺激下引导并记录心房肌Fc。可见10 μmol/L ACh使心房肌收缩幅度立即减低,约10 s后, 收缩曲线呈一条直线, Fc的抑制率为100% (n=6, P＜0.01)。在ACh继续存在的情况下, ACh的作用逐渐减弱, Fc降至最低后又逐渐增大,即发生了所谓的“脱敏”现象。快速洗去ACh后心房肌Fc继续增大, 甚至超过给药前水平, 即发生了所谓的“反跳”现象, 随后又逐渐恢复至给药前水平。心室肌Fc记录方法同心房肌。10 μmol/L ACh可使心室肌收缩幅度逐渐减低, 约15 s后, 收缩幅度降至最低, 此时Fc抑制率为37.57±2.58%(n=6, P＜0.01)。同心房肌一样, ACh对心室肌Fc的作用也出现了“脱敏”及“反跳”现象 。

2.3 ACh对心房肌、 心室肌AP及Fc直接作用的浓度效应关系

刺激频率为1 Hz。结果表明ACh对离体豚鼠心房肌APD的缩短作用 (n=33)及负性肌力 (n=38)作用均随ACh浓度的增大而增强。图3A、 b中的空心圆点曲线分别为以ACh浓度的对数值为横坐标和以APD及Fc出现最大反应的变化率为纵坐标所作的浓度-效应关系曲线。采用自身配对t检验统计, 结果表明, aCh对心房肌的最低作用浓度约为1 nmol/L, 用Scott法将曲线直线化后求得ACh对二指标的KD值分别为 0.275 和 0.135 μmol/L。 ACh 对离体豚鼠心室肌APD的缩短作用 (n=36)及负性变力作用 (n=36)也随ACh浓度的增大而增强。但与心房肌不同的是ACh对心室肌APD的缩短作用及负性变力作用较弱。自身配对t检验统计表明ACh对心室肌的最低作用浓度约为10 nmol/L, 同样用Scott法求得ACh对心室肌APD及Fc作用的KD值分别为0.575和0.676 μmol/L。采用组间t检验将各浓度下ACh对心房肌的效应与心室肌效应对比,从10 nmol/L到0.1 mmol/L均有显著的统计学差异 (P＜0.01), 可见心房肌对ACh的敏感性大于心室肌。

2.4 ACh对心室肌APD缩短作用的机制

2.4.1 阿托品对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 10 μmol/L ACh使心室肌APD由296.72±33.79 缩短至275.18±28.87 ms (n=6, P＜0.01), 而APA变化不明显。此时再加入10 μmol/L阿托品, 可见AP逐渐恢复, APD由275.18±28.87变宽至302.40±35.22 ms (n=6, 与ACh组比P＜0.01) (表2)。已知阿托品是M受体的非选择性竞争性阻断剂,单独使用对心室肌细胞AP几乎无作用, 可见该药阻断了等摩尔浓度ACh对心室肌AP的直接作用 (图4A)。

2.4.2 CsCl对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 加入ACh前, 在台氏液中事先加入20 mmol/L CsCl, 可见心室肌APD由282.42±15.43增宽至302.70±24.07 ms (n=6, P＜0.01)。此时再加入10 μmol/L ACh, 可见APD各参数变化不明显, 加入ACh前后的APD分别为302.70±24.07及298.64±25.01 ms (n=6, 与CsCl组比P＞0.05) (图4B, 表3)。

2.4.3 CdCl2对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 加入ACh前, 在台氏液中事先加入0.1 mmol/L CdCl2, 可见心室肌APD由278.40±23.54缩短至216.18±54.88 ms (n=6, P＜0.01), APA由90.54±9.35 降低至76.96±6.36 mV (n=6, p＜0.01)。此时再加入10 μmol/L ACh, APD继续缩短, 由216.18±54.88 缩短至184.98±56.06 ms (n=6,与CdCl2组比 P＜0.01), 而加入ACh 前后APA分别为76.96±6.36及74.79±7.26 mV (n=6, 与CdCl2组比P＞0.05)。

3 讨论

副交感神经递质ACh对心房肌具有直接抑制作用的观点已被证实, ACh与心房M受体结合后偶联G蛋白直接激活心房K(ACh)通道, 使复极期K+外流加速, aPD缩短, 并且ACh可能通过影响心房Ca2+电流或Na+电流进而降低心房APA[4, 5],但其具体机制目前仍不清楚。有关ACh对心室肌有无直接作用的观点仍存在很多争议。以往观点认为, 在心室肌没有被儿茶酚胺类物质激活时, aCh对其无直接作用。而我们的实验从AP、 Fc等方面证实了ACh对离体豚鼠心室肌有直接抑制作用。它可使标本兴奋性降低, APD缩短, fc降低。这与Boyett等与Litovsky等在离体雪貂和狗心室肌上观察的结果一致[5, 6]。本研究表明,阿托品可拮抗等摩尔浓度ACh对离体豚鼠心室肌AP的直接作用, 由此可推断ACh对心室肌AP的直接作用是M受体介导的。已知M受体是鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)偶联的受体家族成员之一, 因此推测ACh对心室肌的直接作用可能由G蛋白介导[7, 8]。已知CdCl2是钙通道的竞争性拮抗剂, 0.1 mmol/L cdCl2可从细胞外阻断Ca2+电流。在CdCl2存在的情况下, 10 μmol/L ACh仍可缩短心室肌APD,此时APD的变化率与ACh单独作用的变化率相比无统计学差异 (n=6, P＞0.05)。由此推测, aCh