摘要：血管平滑肌细胞增殖的同时伴有细胞内肌动蛋白分布的改变, 这种改变受PKC-MAPK信号转导途径调控, 但目前机制尚不清楚。为探讨胰岛素对PKC-MAPK信号转导途径参与调控血管平滑肌细胞增殖及细胞内肌动蛋白分布的影响,本研究用PKC抑制剂预处理SHR大鼠体外培养的血管平滑肌细胞,观察预处理的血管平滑肌细胞经胰岛素刺激后细胞内DNA的合成、MAPK的活性、表达及细胞内肌动蛋白的分布。发现, 胰岛素刺激后可使血管平滑肌细胞增殖,同时伴有[3H]TdR掺入增加、MAPK活性及表达与对照组比较明显升高。这些作用可被PKC抑制剂阻断。胰岛素在刺激血管平滑肌细胞增殖的同时也使细胞内肌动蛋白重新分布,这一效应也可被PKC抑制剂阻断。上述结果提示, 胰岛素使血管平滑肌细胞增殖的效应可能与MAPK信号转导途径有关。高血压的发病机制十分复杂, 其主要病理改变是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增生、 肥大,造成血管壁肥厚, 管腔狭窄。已有人报道胰岛素对VSMC增殖及DNA合成有促进作用[1], 而这一促进作用是通过激活PKC-MAPK途径[2]。丝裂原活化蛋白激酶家族是与细胞增殖调控关系最为密切的细胞内信号转导蛋白激酶,是细胞外信号与细胞核之间信息传递的共同通路[3]。最近有人报道, 胰岛素不仅能激活Erks, 也能激活p38MAPK, Jun-N-terirol kinase,这些MAPK家族成员都参与调控细胞增殖。胰岛素刺激信号转导途径不仅涉及胰岛素与受体的结合及酶级联反应, 同时也涉及核内蛋白质、脂类调控激酶磷酸化的过程[3]。胰岛素通过这样的信号途径来调控细胞结构及细胞增殖的同时是否伴有细胞的迁移,目前对于细胞内结构与细胞分子之间信息的相互作用以及迁移了解甚少, 尚不清楚是否与血管平滑肌细胞内的肌动蛋白重新分布有关,从而导致血管平滑肌细胞内骨架发生改变。本研究观察了SHR大鼠血管平滑肌细胞经胰岛素及PKC抑制剂作用后肌动蛋白分布的变化和细胞内F-actin, G-actin及MAPK活性的变化,从而探讨胰岛素-PKC-MAPK途径在血管平滑肌细胞增殖过程中其细胞内肌动蛋白的分布发生变化的机制。

1材料和方法

1.1 材料SHR大鼠由北京阜外医院动物所提供; DNA酶I(deoxyribonuclease I)、 鬼必环肽(phalloidin)购自Molecular probes, 佛波脂(PMA), leupeptin、 insulin、 PMSF购自Boehringer Mannhem公司; 胎牛血清和DMEM购自GIBCO公司;羊抗兔抗体购自中山公司; γ-32P-ATP购自北京亚辉原子能研究所; phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)、髓磷脂基质蛋白(myelin basic protein MBP)、 PKC抑制剂(bisindolymaleimide)、抗MAPK多克隆抗体购自Sigma公司,[3H]TdR购自中国医学科学院原子能研究所。

1.2 方法

1.2.1 SHR大鼠VSMC的培养选6周龄的SHR大鼠, 按参考文献[5]方法分离和传代培养VSMC。 细胞鉴定后第4周开始转种传代,本实验用第6～8代细胞。

1.2.2 分组(1) 空白对照组: 不加任何刺激; (2)胰岛素组: 终浓度为10 μmol/L; (3) PMA组: 终浓度为1 nmol/L; (4) pKC抑制剂组: 终浓度为2 μg/ml; (5) 抑制剂+胰岛素组: 加入终浓度为2 μg/ml的PKC抑制剂预处理12 h后,再加入与胰岛素组同样浓度的胰岛素; (6) 抑制剂+PMA组: 加入终浓度为2 μg/ml的PKC抑制剂预处理12 h后, 再加入与(3)组同样浓度的PMA。

1.2.3 [3H]TdR掺入法测VSMC DNA合成量制备2×105 cells/ml悬液接种于24孔培养板, 孵育12 h, 贴壁后换无血清DMEM培养液。12 h后每孔分别加入(第1、 2、 3组不加)PKC抑制剂2 μg/ml, 孵育12 h后再分别加胰岛素 10 μmol/L或PMA 1 nmol/L(第1、4组不加)。 孵育 16 h后每孔加入[3H]-Thymidine 37 kBq/ml, 孵育8 h, 加冷0.01 mol/L PBS液终止反应。在Millipre上经微孔滤膜收集细胞并用10%三氯醋酸处理,滤膜烘干后置闪烁液瓶中, 加入闪烁液在液闪计数仪上测定3H的放射性。

1.2.4 SHR大鼠VSMC的生长曲线取对数生长期的VSMC, 以1×105 cells/ml接种于50 ml培养瓶中, 每组两瓶。24 h计数一次, 连续5 d, 以细胞增殖数目表示细胞增殖程度。

1.2.5 流式细胞仪检测SHR大鼠DNA含量取对数生长期的VSMC, 以1×105 cells/ml接种于六孔培养板中, 按上述分成六组。培养结束后,用PBS液洗涤2次, PBS配制成细胞悬液, 使细胞数量为1×106 cells/ml。 1000 r/min离心5 min, 去上清,细胞沉淀中加入70%乙醇固定30 min; 1000 r/min离心5 min, 去上清, 用PBS重悬细胞沉淀, 加入等量的RNAase (500 u/ml), 37℃作用30 min, 用PBS洗去RNAase, 制成细胞悬液, 将等量的EB染料逐滴加入经RNAase处理过的细胞悬液中室温中放置30 min。

1.2.6 MAPK免疫印迹及活性测定按常规的方法改进。接种1×106 cells/ml于24孔培养板, 孵育12 h后移至无血清培养液培养12 h。分别加或不加PKC抑制剂2 μg/ml, 孵育12 h后再加入胰岛素 10 μmol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育10 min。用冷PBS液洗涤细胞后换MAPK提取缓冲液(mmol/L): (HEPES 10 pH 7.4、 EDTA 5、 EGTA 5、 焦磷酸钠 50、 naF 50、 钒酸钠 0.1、 NaCl 50， 0.01% Triton X-100)。 在冰上孵育30 min, 14000 r/min, 4℃ 30 min, 取上清, 用10% SDS-PAGE电泳, 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度; 另调蛋白浓度至200 μg /ml, 以备测量MAPK活性。MAPK免疫印迹：取20μg /ml蛋白样品行10% SDS-PAGE电泳, 按常规方法进行电转印于硝酸纤维膜, 抗MAPK抗体浓度为1∶5000, 4℃过夜, PBST洗5 min(3次), 按SP试剂盒说明书进行酶显色反应。用胶内髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein MBP)原位磷酸化法[5]测定VSMC中MAPK活性。取20μg/ml蛋白样品, 行10% SDS-PAGE电泳, 凝胶经充分洗脱、 酶变性和复性处理, 复性后的凝胶与γ-32P-ATP 185 kBq/ml共同孵育,再用含1% 焦磷酸钠的5%(W/V)三氯乙酸溶液洗脱凝胶, 然后行干胶放射自显影。将相对应的凝胶切下, 置于液闪液中进行计数,测定32P掺入的放射活性。MAPK活性用cpm/(min·mg pro.)表示, 各组均为复管测定, 同一实验重复5次。

1.2.7 SHR大鼠的VSMC的F-actin、 G-actin萤光染色培养的大鼠VSMC制备成2×105 cells/ml悬液接种于六孔培养板内的载玻片上,孵育12 h, 贴壁后换无血清DMEM培养液12 h, 然后每孔分别加入(对照组不加)PKC抑制剂2 μg/ml, 孵育12 h后再加入胰岛素 10 μmol/L和PMA1 nmol/L, 37℃作用20 min后取出载玻片, 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)液洗2次(5 min/次),然后用4％多聚甲醛室温固定30 min, 按Molecular probes说明书进行萤光染色, 用共聚焦显微镜观察。

1.3 统计方法结果以mean±SD表示, 用Microsoft Excel统计程序进行均数差异性显著分析, P＜0.05为差异显著, 有统计学意义。

2结果

2.1 胰岛素影响SHR 大鼠VSMC增殖的生长曲线及细胞周期

2.1.1 胰岛素对SHR的VSMC增殖生长曲线的影响通过检测各组VSMC的生长情况, 可以看出, 与空白对照组相比, 胰岛素、 PMA组的VSMC生长速率增加(P＜0.01),而用PKC抑制剂组及先用PKC抑制剂预处理再用胰岛素、 PMA刺激的细胞生长速率, 与空白对照组相比无显著差异(P＞0.05), 并且因有PKC抑制剂的影响,在后三天的细胞几乎不增殖。

2.1.2 胰岛素对SHR 大鼠VSMC的DNA合成和细胞周期的影响[3H]TdR掺入实验结果表明, 用PKC抑制剂预处理VSMC 24 h, 可使PKC活性抑制; pKC活性被抑制后, 胰岛素和PMA对VSMC的[3H]TdR掺入到DNA中的量随之减少。通过流式细胞仪测定SHR大鼠VSMC细胞, 结果表明, 胰岛素和PMA使VSMC细胞G1期的百分率分别下降30%和29%, s期和G2+M期百分率分别升高45%和20%。而用PKC抑制剂预处理的VSMC, 再用同等条件的胰岛素、 PMA刺激, VSMC增殖与对照相比无显著差异。

2.2 胰岛素对SHR大鼠血管平滑肌细胞增殖和MAPK活性的影响

2.2．1 胰岛素对VSMC内MAPK活性的影响SHR大鼠的VSMC在胰岛素作用后, MAPK活性与对照组相比显著增高, 给予胰岛素组(492.8 pmol32P/min·mg－１) 与 空白组(121.1 pmol 32P/min·mg－１)相比差异显著(P＜0.01＝。然而, 若给予PKC抑制剂处理24 h,可使胰岛素对MAPK的促活作用明显受抑制, SHR胰岛素+ PKC抑制剂(118.2 pmol 32P/min·mg－１) 与 胰岛素组(492.8 pmol32P/min·mg－１)相比, 差异显著(P＜0.01＝。胰岛素+ PKC抑制剂(118.2 pmol 32P/min·mg－１)与空白组(121.1, pmol 32P/min·mg－１)相比, 差异不显著(P＞0.05)。

2．2．2 胰岛素对SHR 大鼠VSMC内MAPK含量的影响胰岛素刺激组的SHR大鼠VSMC的MAPK含量经免疫印迹(Western blot)检测,显示明显高于空白对照, 而加入PKC抑制剂作用24 h后再给予胰岛素和PMA, 其细胞MAPK蛋白含量与空白对照组无明显差异。

2．3 胰岛素对SHR大鼠血管平滑肌细胞骨架蛋白的影响

用胰岛素刺激培养SHR大鼠血管平滑肌细胞后, 可明显见到细胞骨架F-actin重新分布(图5中绿色、 黄色丝状物), 并且G-actin在细胞膜上有聚集现象。经胰岛素刺激后VSMC中F-actin有向细胞膜集中的趋势(与图5A比较,箭头所示), G-actin在细胞膜周围荧光明显增强。血管平滑肌细胞经PKC抑制剂处理后, 再用胰岛素刺激, 细胞膜上F-actin、 G-actin的集聚作用减弱。用胰岛素刺激VSMC的同时,用PMA做阳性对照与胰岛素作用的结果相似。

3讨论

3．1 胰岛素对SHR大鼠VSMC增殖的影响

胰岛素和PMA一样有较强的促离体VSMC增殖作用, 在SHR组的第二天, VSMC 细胞数有明显 的减少, 第三天开始又与 PMA