摘要：采用Langendorff灌流大鼠心脏和酶解分离的心肌细胞为实验模型, 研究铁负荷下心肌损伤情况以及一氧化氮(NO)在铁诱导的心肌损伤中的地位。结果显示:(1)心肌铁负荷(Fe-HQ)可使分离心肌细胞舒张期细胞长度缩短、 收缩幅度和速度降低, 离体灌流心脏左室发展压(LVDP)、 ±dp/dtmax、冠脉流量呈现双相变化; 冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)、 肌酸激酶(CK)释放量和心肌丙二醛(MDA)增高。 (2)NO的前体L-精氨酸(L-arginine, l-Arg)引起心肌细胞舒张期细胞长度缩短、收缩幅度降低。离体灌流心脏LVDP、 冠脉流量、 和±dp/dtmax增高, 用K-H液复灌后可恢复正常。(3)L-Arg预处理, 再行Fe-HQ灌流, 与单纯的L-Arg或Fe-HQ组相比, 心肌细胞舒张期细胞长度、 收缩幅度和速度减小; 离体灌流心脏LVDP、±dp/dtmax、 心率和冠脉流量明显下降, 冠脉流出液中LDH、 CK增加。 (4)Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和Fe-HQ合并灌流后,与单纯Fe-HQ组相比, 心肌细胞舒张期细胞长度、 收缩幅度和速度增加。L-NAME可阻断Fe-HQ引起的LVDP、左室舒张末压(LVEDP)和±dp/dtmax降低,冠脉流出液中LDH、 CK增高。 (5)用Triton X-100短暂处理以去除冠脉内皮后, 与保留冠脉内皮的心肌相比, Fe-HQ引起的LVDP和±dp/dtmax的一过性增高现象被抑制,但对复灌期LVDP和±dp/dtmax的改变无明显影响。上述实验结果表明, L-Arg可加重铁诱导的心肌损伤作用; L-NAME可通过抑制NOS减轻铁引起的心肌损伤,其中冠脉内皮参与了铁的早期心肌作用。心肌缺血常见于急性心肌梗死的病人。实验证明, 心肌缺血后, 心肌细胞内的低分子量铁含量急剧增加, 约为正常的27倍,心肌铁的增加是引起心肌缺血/复灌损伤的主要原因之一[1]。在许多组织和细胞中, 氧自由基(尤其是羟自由基·OH)的产生和增加被认为是铁诱导的损伤的共同机制。然而Oubidar等人研究表明,将心脏暴露于Fe3+-HQ或枸橼酸铁,冠脉流出液中的·OH并无明显增加[2]。心脏灌流液中·OH的产生量和心肌功能异常之间并无明显的相关性[3]。在缺血/复灌心脏,超氧化物岐化酶和过氧化氢酶虽然可降低复灌期·OH的产生, 但并不能减少复灌引起的心律失常的发生率[4]。因此,目前没有直接的证据证明·OH确实参与铁诱导的心肌功能不良。大量的研究表明, 铁和氧自由基可影响一氧化氮(NO)代谢产物的水平和NOS的表达。经脂多糖处理的动物体内,铁可通过增加iNOS的活性增加肝脏、 心脏和肾脏等组织中的NO的产生[5]。在原代培养的近曲小管细胞中, 铁可通过增加NOS活性和NO的产生,导致细胞产生毒性[6]。在心肌细胞中, NO是否参与铁诱导的心肌损伤, 目前仍不明了。本实验的目的是, 在Langendorff灌流的大鼠心脏和酶解分离的成鼠心肌细胞上观察L-Arg和N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) 在铁的心肌效应中的作用。

1 材料和方法

1.1 动物和试剂 雄性Sprague-Dawley大鼠(220~270 g)由浙江大学实验动物中心提供。FeCl3·6H2O为上海金山化工厂产品。8-羟基喹啉(8-hydroxyquinoline, 8-HQ)、 L-Arg、 l-NAME和Triton X-100均为Sigma公司产品。临用前, 将FeCl3·6H2O与8-羟基喹啉按1:2的比例混合,形成透膜的脂溶性复合物Fe-HQ[2]。

1.2 离体心脏Langendorff灌流和左室功能评价 雄性SD大鼠, 用木锤击昏后, 迅速取出心脏, 置于4℃改良Krebs-Henseleit溶液(K-H液)中除去血液;然后迅速转移、 固定于Langendorff灌流装置, 以改良K-H液行常规恒压灌流(76 mmHg)。改良K-H液成分(mmol/L): NaCl118.0、 KCl 4.7、 K2PO4 1.2、 MgSO4 1.2、 NaHCO3 25.0、 CaCl2 1.25、 葡萄糖10.0, pH 7.4,以95％ O2＋5％ CO2饱和, 维持灌流液温度于37℃[7]。采用左心室内水囊传递压力测定心室内压; 心电电极分别置于肺动脉圆锥及心尖部。通过MedLab生物信号采集处理系统记录心电图(ECG)和左室收缩曲线,并计算左室舒张末压(LVEDP)、 左室发展压(LVDP)、 心率、 ±dp/dtmax。

1.3 心室肌细胞酶解分离和收缩的测定 用雄性SD大鼠(200~250 g)离体心脏行恒流灌流(流速为10 ml/min, 37℃)。先以无钙台氏液灌流5 min, 无钙台氏液成分(mmol/L): NaCl 100、 KCl 10、 KH2PO4 1.2、 MgSO4 5.0、 葡萄糖 20.0、 牛磺酸20.0、 MOPS 10.0 (pH 7.2)。再以含Ⅰ型胶原酶0.35 mg/ml的无钙台氏液灌流11 min。然后将心室肌取下、 剪碎、 吹打,复钙至终浓度1.25 mmol/L。静置2 h后, 取细胞悬液滴于玻璃底灌流槽中, 以改良K-H液按2 ml/min持续灌流, 溶液以95％ O2＋5％ cO2饱和, 温度32℃。并施加频率为0.4 Hz、 强度为两倍阈强度的电场刺激。用MedEase视频跟踪计算机图像分析系统, 记录并分析心室肌细胞的收缩幅度、±dL/dtmax和舒张期心肌细胞的长度。

1.4 心肌损伤和脂质过氧化指标的分析 在相应时点记录冠脉流量, 同时收集冠脉流出液, 用全自动生化分析仪(美国Beckman公司, cX-4型)分析其中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的释放量。实验结束后取下心脏称重, 以硫代巴比妥酸法测定MDA, 用考马斯亮蓝法定量蛋白质。

1.5 实验分组 A大组为酶解分离心肌细胞组, B大组为离体灌流心脏组。酶解分离心肌细胞(n=6)和离体灌流心脏(n=7~8)分别稳定15 min后,行以下处理。对照组: 继续灌流45 min。Fe-HQ组: K-H液灌流5 min后, 用Fe-HQ (5 μmol/L)灌流10 min,持续K-H液灌流30 min。L-Arg组: L-Arg (0.5 μmol/L)灌流5 min后, 再用K-H液灌流40 min。L-Arg+Fe-HQ组: l-Arg (0.5 μmol/L)灌流5 min后, Fe-HQ (5 μmol/L)灌流10 min, 再用K-H液灌流30 min。L-NAME+Fe-HQ组: K-H液灌流5 min后, 用Fe-HQ (5 μmol/L)和L-NAME (100 μmol/L)合并灌流10 min, 持续K-H液灌流30 min。Triton X-100处理组: 用0.1 ml Triton X-100 (0.05%)快速灌流心脏后[8],以除冠脉内皮细胞, 再用Fe-HQ (5 μmol/L)灌流10 min, 持续K-H液灌流30 min。

1.6 统计处理 各组数据以mean±SE表示, 采用one-way ANOVA以及Newman-Keuls post hoc test做统计学分析。Ｐ＜0.05认为有显著差异。

2 结果

2.1 Fe-HQ对酶解分离心室肌细胞和离体灌流心脏的作用

用Fe-HQ灌流心肌细胞后, 引起舒张期细胞长度缩短、 收缩幅度降低、 ±dL/dtmax减小 (P＜0.01) 。Fe-HQ引起离体灌流心脏冠脉流量、 LVDP和±dp/dtmax双相变化, 即先增加, 随后逐渐降低(图2, 表1)。LVEDP明显增高(表2)。心率下降, 冠脉流出液中LDH、 CK的量增加,心肌MDA增高(表3)。

2.2 L-Arg对酶解分离心室肌细胞和离体灌流心脏的作用

l-Arg引起舒张期心肌细胞长度缩短与收缩幅度降低。L-Arg灌流心脏5 min后, 可引起心脏LVDP、 冠脉流量和±dp/dtmax增高。用K-H复灌后可恢复正常(表1)。

2.3 L-Arg对Fe-HQ灌流心脏的作用

l-Arg预处理心肌细胞5 min后, 用Fe-HQ进行灌流, 与单纯的L-Arg和Fe-HQ组相比, 舒张期心肌细胞长度缩短、 收缩幅度降低, ±dL/dtmax减小;但复灌时, 心肌细胞的收缩幅度和±dL/dtmax与单纯Fe-HQ组无区别。L-Arg+Fe-HQ灌流心脏组, 与单纯Fe-HQ或L-Arg灌流相比, LVDP、±dp/dtmax、 心率和冠脉流量明显下降(图2, 表1), 冠脉流出液中LDH、 CK的量增加。但心肌MDA较单纯Fe-HQ组降低。

表 1. Fe-HQ、 L-Arg、 L-NAME和Triton X-100对离体灌流心脏冠脉流量(ml/min)的影响。

2.4 L-NAME对Fe-HQ灌流心脏的作用的影响

用Triton X-100短暂处理以去除冠脉内皮后, 与保留冠脉内皮的心肌相比, Fe-HQ引起的LVDP和±dp/dtmax的一过性增高现象被抑制。但对复灌期LVDP和±dp/dtmax的改变无明显影响(图2),冠脉流出液中LDH、 CK的量, 心肌MDA的含量与单纯Fe-HQ组相比无差异

3 讨论

本实验将铁与一种细胞可渗透性配基8-羟基喹啉结合形成复合物Fe-HQ, 它可以促进铁进入心肌细胞内并阻止铁重新转运出细胞,从而增加心肌细胞内铁的浓度。用Fe-HQ灌流心脏15 min后,铁的摄取量是从水溶性铁复合物(枸橼酸铁)摄取量的8~9倍[2]。将培养的内皮细胞在Fe-HQ中孵育15 min后, 74%的铁进入细胞[9]。本实验发现, fe-HQ可引起灌流的离体心脏和酶解分离的心肌细胞的功能异常, 脂质过氧化程度增加,而水溶性铁复合物对心肌功能影响明显小于Fe-HQ[10]。Fe-HQ引起心功能异常呈浓度依赖性关系, 当Fe-HQ的浓度达5 μmol/L时,心肌损伤性的标志酶LDH和CK以及脂质过氧化程度明显增高。同样, 其他研究者的报道亦证明, 5 μmol/L是产生氧自由基的催化浓度[11]。心肌单纯暴露于8-HQ(10 μmol/L)对心脏的各指标并无明显影响。据报道, Fe3+-HQ易被细胞内的还原性物质(如坏血酸)所还原,而在有氧情况下Fe2+-HQ可被快速氧化[12], 因此, Fe3+-HQ在心肌细胞内易发生还原-氧化反应。

从本实验结果看, 铁和L-Arg联合使用可降低心肌收缩幅度、 ±dp/dtmax和±dL/dtmax等, 可能是由于铁抑制肌浆网ryanodine受体的结合特性,导致外钙内流诱发的内钙释放减少[13]。 而文献报道NO可降低心肌对β-肾上腺素激动剂的反应性, 导致钙瞬态下降[14],故推测NO可直接或间接地加重铁对肌浆网钙释放的抑制, 或生成了更具毒性的物质, 从而影响心肌收缩功能。心肌铁和L-Arg联合使用可抑制铁诱发的LVEDP的增高,可能与NO可增加肌浆网对钙的重摄取或影响线粒体钙泵的功能和活性有关。但目前缺乏直接的证据, 尚待进一步的研究。

实验发现, 在离体灌流心脏和分离的心肌细胞模型上, L-Arg可加重铁引起心肌损伤, 而L-NAME可对抗铁负荷的心肌损伤作用,提示NO<