摘要：实验利用大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)作为模型，观察17-β雌二醇(E2)对VSMC增殖和原癌基因c-fos表达的影响，并探讨VSMC源性一氧化氮(NO)在其中的作用。检测指标包括NO释放的测定、细胞计数、 3H-Tdr掺入、 噻唑蓝(MTT)测定和c -fos mRNA表达。结果显示，E2(10-12~10－８ mol/L)呈浓度依赖性地促进VSMC中NO的释放；10－８ mol/L E2 能明显抑制10％小牛血清(FCS)和10－７ mol/L 内皮素-1(ET-1)诱导的细胞增殖和DNA合成，E2的抑制作用均可被雌激素受体 (ER) 拮抗剂tamoxifen (10－７ mol/L)和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(10－６ mol/L)明显减轻；E2(10－８ mol/L)可明显抑制10－７ mol/L ET-1诱导的VSMC c -fos表达，这种抑制作用可被L-NAME (10－６ mol/L) 明显减轻。这些结果提示E2能抑制VSMC增殖和原癌基因c -fos表达，这和促进VSMC的NO释放密切相关，而且该作用至少部分通过ER介导。有大量证据表明绝经前妇女的心血管病发病率远远低于同龄男性，而绝经后这种差别则不复存在，这提示雌激素对心血管系统具有保护作用。在动脉粥样硬化(AS)的发病过程中，内皮功能下降和血管平滑肌的增殖是两大重要因素。近年来,较多的研究集中在雌激素的内皮保护方面，包括促进血管内皮依赖性舒张，促进血管内皮细胞释放一氧化氮(NO)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 的表达[1]。 但也有研究发1期杨丹等: NO在17-β雌二醇抑制血管平滑肌细胞增殖和原癌基因c -fos表达中的作用现雌激素对血管平滑肌(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖有直接抑制作用[2]。 而这种作用不依赖于内皮释放NO, 如17-β雌二醇(E2)能诱导去内皮的动脉条iNOS的表达和NO的产生来减弱去内皮的大鼠动脉的收缩反应[3],这提示雌激素对血管张力的调节与VSMC自身NO系统有关。 因此, 有必要确定雌激素对VSMC的直接抑制作用是否也与VSMC自身释放的NO有关。为此,本研究观察了E2对大鼠VSMC增殖和原癌基因c -fos表达及NO释放的影响, 并探讨了NO、 NOS和ER在其中的作用,以进一步阐明雌激素抗动脉粥样硬化的机制。

1材料和方法

1.1 VSMC的培养[4]取150～200 g雌性SD大鼠(中山医科大学动物中心提供)的胸主动脉。 用贴块法培养VSMC,实验采用第4代培养细胞。培养液为含10%小牛血清的无酚红DMEM, 给药前24 h换用无血清而加入转铁蛋白等补充营养的无酚红DMEM。

1.2 NO释放的测定[1] 用Nitrit/Nitrat Farbtest 试剂盒,以比色法测定培养液和细胞内的硝酸盐总量。以每培养瓶106个细胞的密度接种细胞, 分别收集细胞培养液和细胞裂解液(80℃恒温水浴裂解10 min, 12000 r/min离心10 min, 取上清液)进行测定。500 μl样品中加入250 μl NADPH和200 μl硝酸还原酶, 室温下孵育30 min,加入对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺显色15 min, 以紫外分光光度计546 nm波长测定吸光度,再根据标准曲线换算成硝酸盐浓度。细胞培养液和细胞裂解液中硝酸盐浓度之和即为VSMC释放出的硝酸盐总量。

1.3 细胞计数VSMC以105/孔接种于24孔板, 贴壁后换无血清DMEM培养液, 24 h后加药处理3 d, 用胰酶短暂消化后制备成细胞悬液,在倒置光学显微镜下计数。

1.4 DNA合成测定制备2×105 cells/ml悬液接种于24孔板, 贴壁后换无血清DMEM, 24 h后加药, 孵育16 h后每孔加入37 kBq3H-Thymidine(3H-Tdr), 8 h后加入冷PBS液终止反应。 在Millipore上经微孔滤膜收集细胞并用10％三氯醋酸处理、洗净,滤膜干燥后加入闪烁液, 在β闪烁计数仪上测定3H放射活性。

1.5 MTT测定制备2×105 cells/ml悬液接种于96孔板, 贴壁后换无血清DMEM, 24 h后加药, 孵育24 h后每孔加入100 μg MTT。继续培养5 h后去除培养液, 每孔加入0.2 ml DMSO, 振摇10 min后用酶联免疫检测仪测定光密度值(OD值, 检测波长570 nm, 参考波长630 nm), 通过与对照值的比较得到实验组的存活值。

1.6 c -fos mRNA的表达检测 用TRIzol试剂盒提取细胞RNA, 提取后用紫外分光光度计测定其浓度和纯度,计算样品总RNA浓度。根据Yang等[5]报道的序列合成VSMC的c -fos寡核苷酸引物, 其序列为：上游5′-GGT CAT CGG GGA TCT TGc-3′, 下游5′-GGG CTC TCC TGT CAA c -3′。利用该对引物可扩增出510 bp的c -fos cDNA片段, 内标GAPDH的寡核苷酸引物是根据Fort等[6]报道的序列合成：上游5′-CAT cAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′, 下游 5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′, 利用该对引物可扩增出443 bp的GADPH cDNA片段。取样品总RNA 2 μg, 加入0.4 (mol/L 特异性c -fos mRNA引物.采用TitanTM一步法RT-PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应(RT-RCR),扩增条件参考试剂盒说明书(94℃变性2 min×1次→94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 68℃延伸45 s×10次→94℃变性30 s,60℃退火30 s, 68℃延伸45 s, 每次循环延伸时间延长5 s×25次→68℃延伸7 min), 总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物8 μl,加2 μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5 %琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳条件为68 V、 45 min。以GDS凝胶成像系统拍摄电泳图谱,并进行相应分析。

1.7 试剂 Nitrit/Nitrat, Farbtest试剂和TitanTM one Tube RT-PCR Kit均由Boehringer mannheim公司提供。TRIzol试剂, DMEM, fetal bovine serum (FCS)为Gibco公司产品。17-β雌二醇(17-β estraoliol, E2), tamoxifen, 内皮素-1(endotheline 1, ET-1), NG-硝基左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methylester, L-NAME), 噻唑蓝(3-[4,5-DimethylthiazoL-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT), 琼脂糖(agrose)均为Sigma产品。c -fos引物序列和GAPDH引物序列在上海生工生物工程公司合成。

1.8 实验分组 (1) 空白对照组; (2) serum处理组; (3) E2+serum组; (4)tamoxifen+E2+serum组;(5)L-NAME+E2+serum组; (6)ET-1处理组; (7)E2+ET-1组; (8)tamoxifen+E2+ET-1组;(9)L-NAME+E2+ET-1组; (10)E2组; (11)tamoxifen组; (12)L-NAME组。

1.9 统计处理结果以mean±SD表示, 以方差分析, 组间t检验作统计学处理, P＜0.05被认为有统计学差异。

2结果

2.1 E2对VSMC NO释放的影响

nO释放量用培养液和细胞内硝酸盐总量之和表示。与对照组比较, 以10－12 mol/L、10－１０ mol/L 及10－８ mol/L的 E2处理VSMC 48 h, 使培养液和细胞内硝酸盐总量从80.4 ±5.8分别增加到103.0 ± 4.9(Ｐ＜ 0.001), 108.9 ± 2.5(Ｐ＜ 0.001),112.9± 2.4(P＜0.001), 分别增加了(28.3±7.6)%, (35.9±7.8)% 和(41.1±9) %(n= 6, Ｐ ＜ 0.001)。

2.2 E2对VSMC细胞计数的影响

以空白对照为100％, 10％FCS作用3 d使细胞计数增加了(119.4±13.3)％(n＝4, Ｐ＜0.001), 该作用被10－８ mol/L e2预处理24 h后明显抑制, 抑制率为(45.8±2)％(n＝4, Ｐ＜0.001)。预先给予10－６ mol/L L-NAME和10－７ mol/L tamoxifen 半小时, 使E2的抑制10％FCS诱导细胞增殖的作用分别减轻了(87±15.4)％(n＝4, Ｐ＜0.001)和(76.1±6)％(n＝4,Ｐ＜0.001); 10－７ mol/L ET-1作用3 d使细胞计数增加了(100.9±20.9)％(n＝4, Ｐ＜0.001), 该作用被10－８ mol/L E2预处理24 h后明显抑制, 抑制率为(44.3±2.5)％(n＝4, Ｐ＜0.001), 预先给予10－６ mol/L L-NAME和10－７ mol/L tamoxifen 半小时使E2的抑制10－７ mol/L ET-1诱导细胞增殖的作用分别减轻了(83.1±8.8)％(n＝4,Ｐ＜0.01)和(83.5±1.3)％(n＝4, Ｐ＜0.001)。

2.3 E2对VSMC 3H-Tdr掺入率的影响

与空白对照组相比, 10％ FCS和10－７ mol/L ET-1分别使VSMC 3H-Tdr掺入的cpm值从631.2±145.5增至3589.3±807(n＝6,Ｐ＜0.001)和1553.3±481.9(n＝6, Ｐ＜0.01)。E2预处理24 h后对FCS和ET-1诱导的VSMC 3H-Tdr掺入均有抑制作用,且抑制作用随浓度增加而增大, 10－12 mol/L、10－１０ mol/L 及10－８ mol/L的 E2对10％FCS的这种作用分别抑制了(6.8±3.2)％(n=6,Ｐ＜0.01), (15.8±4)％(n=6, Ｐ＜0.001), (36.3±10.4)％(n=6, Ｐ＜0.001)。10－８ mol/L e2对ET-1的这种作用抑制了(49±8.1)％(n=6, Ｐ＜0.001), 用10－６ mol/L L-NAME预处理半小时后, 10－８ mol/L e2对FCS诱导VSMC 3H-Tdr掺入的抑制作用完全消失(n＝6, Ｐ＜0.01)。对ET-1诱导VSMC3H-Tdr掺入的抑制率从(49±8.1)％下降到(17.7±7)％(n=6, Ｐ＜0.01)。用10－７ mol/L tamoxifen预处理半小时后,完全消除了10－８ mol/L E2对FCS的抑制作用(n=6, Ｐ＜ 0.001), 部分减轻了10－８ mol/L E2对ET-1的抑制作用,抑制率从(49±8.1)％下降到(12.7±5.1)％(n=6, Ｐ＜0.01)。

2.4 E2对VSMC MTT测定的影响

与空白对照组相比, 10％FCS使vs MC MTT的OD值从0.12±0.04增至1.38±0.14(n=6, Ｐ＜ 0.001), 10－８ mol/L e2预处理24 h使之下降到1.18±0.08, 有明显抑制作用(n=6, Ｐ＜ 0.05 vs FCS)。预先给予10－７ mol/L tamoxifen和10－６ mol/L L-NAME 半小时, 可明显消除E2的抑制作用, MTT的OD值分别为1.28±0.13(n＝6, Ｐ＜ 0.05 vs e2+FCS)和1.31±0.11(n=6, Ｐ＜ 0.05 vs E2+FCS); 与对照组相比, 10－７ mol/L ET-1使VSMC MTT的OD值从0.12±0.04增至1.24±0.06(n＝6,Ｐ＜ 0.001), 10－８ mol/L E2预处理24 h, 使之降到1.11±0.05, 有明显抑制作用(n＝6, Ｐ＜ 0.05 vs eT-1)。预先给予10－７ mol/L tamoxifen和10－６ mol/L L-NAME半小时, 可明显消除E2的抑制作用, MTT的OD值分别为1.17±0.07(n＝6,Ｐ＜ 0.05 vs E2+ET-1)和1.16±0.07(n＝6, Ｐ＜ 0.05 vs E2+ET-1)。